Множество взаимодействия за стабилизация на капсидите, разкрити във висока структура

Субекти

Обобщение

Лошо проученият пикорнавирус, човешки пареховирус 3 (HPeV3) причинява неонатален сепсис без налични терапии. Нашата собствена структура с резолюция 4.3-Å на HPeV3 и резолюция 15 Å в комплекси с човешки моноклонални антитела Fab демонстрира очакваната структура на пикорнавирусния капсид с три различни характеристики. Първо, 25% от генома на HPeV3 РНК на 60 места е силно подреден, както е потвърдено от асиметрична реконструкция, и взаимодейства със запазени региони на VP1 и VP3 капсидните протеини. Второ, терминът VP0 N стабилизира вътрешната повърхност на капсида, за разлика от други пикорнавируси, при които при изхвърляне като VP4, той образува канал за транслокация на РНК. И накрая, хидрофобният джоб на VP1, мястото на свързване на антипикорнавирусното лекарство, плеконарил, е блокиран и следователно неподходящ за антивирусно развитие. Взети заедно, тези резултати предполагат посока за развитието на неутрализиращи антитела, антивирусни лекарства, базирани на взаимодействия РНК-протеин, и дисекция на вирусно събрание въз основа на РНК нуклеация.

Въведение

Picornaviridae е семейство от малки, позитивно усетени, икозаедрични симулации, едноверижни РНК вируси. Пареховирус А е вид в това семейство с 16 генотипа и се свързва главно с леки инфекции при хората, особено при децата. Новият патоген, човешки пареховирус 3 (HPeV3), обаче, може да причини сериозни инфекции в централната нервна система, като менингит 1, и е водеща причина за неонатален сепсис 2. Няма налични антивирусни средства или ваксини за борба с HPeV инфекцията. За разлика от много други пикорнавируси, HPeVs са слабо характеризирани както по отношение на структурата, така и по отношение на функцията, с изключение на HPeV1, където рецепторът 3 е известен. Големите разлики в тропизма, показани от HPeV3 в сравнение с другия HPeV, правят изключително важно изследването на структурните свойства на HPeV3 за по-добро разбиране на неговата патогенеза и възможното свързване с рецепторите.

Използвахме криоелектронна микроскопия и реконструкция на изображението, за да анализираме структурата на HPeV3 самостоятелно и в комплекс с човешко моноклонално антитяло Fab. Структурата на вирион показва, че VP1 джобно свързващи лекарства, като плеконарил, е малко вероятно да се свържат с HPeV; че VP0 е важен протеин за стабилизиране на вътрешната повърхност на капсида и накрая, че HPeV сборът вероятно се контролира от множество взаимодействия на генома с капсида, чрез консервирани аминокиселини във VP1 и VP3 и структури на стволови и контурни в РНК. Ние изолираме и охарактеризираме човешко моноклонално антитяло, специфично за HPeV3, което може да бъде много полезно за подобряване на диагностиката на вируси и изучаване на взаимодействията между вируса и гостоприемника.

Резултати и дискусия

Структура на HPeV3

Изображение в пълен размер

Подредена структура на HPeV3 РНК

Изображение в пълен размер

Хидрофобен джоб VP1

Антивирусното лекарство, плеконарил и неговите производни обикновено блокират ентеровирусни инфекции като EV-D68 (справка 4). Тези лекарства изхвърлят липида ("джобен фактор"), присъстващ в хидрофобния джоб на VP1 β-цевта и блокират РНК покритието чрез стабилизиране на капсида 4. Каналът към хидрофобния джоб в HPeV3 VP1 е блокиран от три големи запазени странични вериги Y133, F163 и Y164 (фиг. 1е и 3) в сравнение с EV-D68 (реф. 4). Следователно можем да обясним наблюденията, че плеконарилът не работи в клиника 2 и да прогнозираме, че подобни имитатори на джобни фактори няма да работят срещу нито един от секвенираните досега HPeV.

HPeV3 - Fab сложна структура

Изолирахме специфично за HPeV3 човешко моноклонално антитяло, AT12-015, което се свързва с HPeV3 изолати 152037, A308/99 и два клинични изолата в заразените клетки. Той не неутрализира 152037 в анализ, базиран на клетъчни линии Vero. Структурата на HPeV3 изолат 152037 беше разрешена в комплекс с Fab AT12-015 (допълнителна таблица 1; фиг. 4а; допълнителна фигура 1). Fab молекулите разпознават конформационен епитоп по ръба на цевта (фиг. 4а). Приносът идва от региони както във VP3 (hZβB, βChA, βEβF и βGβH контури), така и във VP1 (βBβC, βCβD и βEβF, C), запазени главно в HPeV3, което обяснява специфичността на антитялото към този генотип (фиг. 3) . Fab пръстовият отпечатък обхваща терминала VP1 C, където много други HPeVs съдържат RGD мотив, за да се свържат с техните интегринови рецептори (Фиг. 3 и 4b) 3. Тъй като AT12-015 е специфичен за HPeV3 и не се свързва с нито един от другите тествани генотипове на HPeV, той може да бъде много полезен при напредването на диагностиката на вирусите и изучаването на взаимодействията между вируса и гостоприемника. Допълнително сравнение с епитопите на неутрализиращите пациентски серуми може да ни помогне да разберем механизма на неутрализация при пациенти 13 .

( да се ) Радиално цветно изоповърхностно представяне на комплекса HPeV3-Fab AT12-015 при разделителна способност 15 Å, показана при 1,5σ над средния праг. Fab молекули (червени) се свързват около района на каньона. ( б ) HPeV3 пътна карта. Отпечатъкът на Fab (червен контур) се преобразува в VP3 (зелен) и VP1 (червен).

Изображение в пълен размер

Като цяло тази работа показва множество стабилизиращи РНК-капсидни взаимодействия като нова цел за антипареховирусни лекарства. Ние разкриваме необичайната стабилност на тези капсиди на ниво интра-пентамер чрез VP3 взаимодействия и на интер-пентамера от VP0 и предполагаме, че механизмът на HPeV покритие на генома ще се различава значително от другите пикорнавируси.

Методи

Пречистване и инактивиране на вируси.

HPeV1-Harris и HPeV2-2008 бяха предоставени от Холандския национален институт за обществено здраве и околна среда, Билтовен, Холандия. HPeV4-251176, HPeV5-552322, HPeV6-550389 и два HPeV3 клинични изолата са получени от Лабораторията по клинична вирусология, Академичен медицински център, Амстердам, Холандия. За вирусни запаси HPeV1, HPeV2, HPeV3 A308/99 (тип подарък Hiroyuki Shimizu и Miyabe Ito) и HPeV4-6 бяха култивирани в клетъчна линия HT29 в минималната основна среда на Eagle с L-глутаминова киселина (0, 2 ×), несъществена Аминокиселини (1x), стрептомицин (0.1 μg ml -1), пеницилин (0.1 μg ml -1) и 2% топлинно инактивиран FBS (HT29 клетки се поддържат в среда, съдържаща 8% FBS топлинно инактивирана). Тези щамове бяха използвани в тестовете за свързване и неутрализиране на антитела AT12-015.