Как работи йонообменната хроматография; Новини-Медицински
Внимание: Тази страница е превод на тази страница първоначално на английски. Моля, обърнете внимание, тъй като преводите се генерират от машини, не че всички преводи ще бъдат перфектни. Този уебсайт и неговите страници са предназначени за четене на английски език. Всички преводи на този уебсайт и неговите уеб страници могат да бъдат неточни и неточни изцяло или частично. Този превод е предоставен за удобство.
Йонообменната хроматография (IEX) е техника, която обикновено се използва при пречистването на биомолекули. Тя включва разделяне на молекулите въз основа на техния заряд.
Тази техника използва взаимното действие между заредените молекули в проба и противоположно заредените части в хартиената фаза на хроматографската матрица. Този тип разделяне е труден при използване на други техники, тъй като натоварването лесно се манипулира от рН на използвания буфер.
Възможни са два вида разделяне на йонообмен - катионен обмен и анионообмен. При анионния обмен неподвижната фаза - заредена, докато при катионообмена е отрицателна - е положително заредена.
Принцип на йонообменната хроматография
IEX хроматографията се използва при разделяне на заредени биомолекули. Суровата проба, съдържаща заредените молекули, се използва като течна фаза. Когато преминава през хроматографската колона, молекулите се свързват с противоположно заредени места в неподвижната фаза.
Отделените молекули въз основа на техния заряд се измиват с помощта на разтвор с различна йонна сила. Преминавайки такъв разтвор през колоната, се получава силно селективното разделяне на молекулите според различните им заряди.
Техниката
Основните стъпки в процедурата за йонообменна хроматография са изброени по-долу:
- Нечиста проба от протеина се зарежда върху йонообменната хроматографска колона при определено рН.
- Заредените протеини ще се свържат с противоположните функционални групи, заредени върху смолата
- Солен градиент се използва за изплакване на отделените протеини. При ниски концентрации на сол, белтъците с малко заредени групи се изхвърлят, а при по-високи концентрации на сол, протеините с няколко заредени групи се промиват.
- Нежеланите протеини и примеси се отстраняват чрез измиване на колоната.
Градиент на рН може да се приложи и за изплакване на отделни протеини въз основа на тяхната изоелектрична точка (pI), т.е. точката, в която аминокиселините в протеина носят неутрален заряд и следователно не мигрират в електрическо поле. Тъй като аминокиселините са йонни състави на цвитер, те съдържат групи, които имат положителни и отрицателни заряди. Според рН на околната среда, протеините носят положителен, отрицателен или никакъв заряд. В тяхната изоелектрична точка те няма да взаимодействат със заредените половини в колоновата смола и следователно не се измиват. Намаляващ градиент на рН може да се използва за изплакване на протеини с помощта на анионообменна смола и нарастващ градиент на рН може да се използва за изплакване на протеини от катионообменни смоли. Това е така, защото увеличаването на рН на буфера на подвижната фаза прави протеина по-малко протониран (по-малко положително зареден), така че той не може да образува йонно взаимодействие с отрицателно заредена смола, което позволява елуирането му. Обратно, понижаването на рН на подвижната фаза ще направи молекулата протонирана (по-малко отрицателно заредена_, което позволява нейното елуиране.