Остра мозъчна травма при мишки, последвана от надлъжен двуфотонен образен протокол (в превод на
Обобщение
Острата мозъчна травма е сериозно нараняване, което до момента не е било лекувано правилно. Мултифотонната микроскопия позволява надлъжно изследване на процеса на развитие на остра мозъчна травма и при изследване на терапевтични стратегии при гризачи. В този протокол са демонстрирани два модела на остра мозъчна травма, изследвани с in vivo двуфотонно изобразяване на мозъка.
Резюме
Въведение
Острата мозъчна травма е проблем на общественото здраве с висока честота на наранявания при инциденти с моторни превозни средства, падания или нападения и голямото разпространение на последващи хронични увреждания. Терапевтичните подходи за лечение на мозъчно увреждане остават напълно симптоматични, ограничавайки ефективността на доболничната, хирургичната и критичната помощ. Това прави социалното и икономическото въздействие на мозъчната травма особено тежко. По различни причини повечето клинични проучвания не показват подобрение на възстановяването след мозъчна травма, използвайки нови терапевтични подходи.
Животинските модели са от решаващо значение за разработването на нови терапевтични стратегии към етап, в който ефикасността на лекарството може да се предскаже при пациенти с мозъчно увреждане. Понастоящем има няколко добре установени животински модели на травма на главата, включително контролирано кортикално въздействие 1, перкусионно нараняване с течност 2, динамична деформация на кората 3, спадане на теглото 4 и фототравма 5. Редица експериментални модели са използвани за изучават някои морфологични, молекулярни и поведенчески аспекти на патологията, свързана с травма на главата. Въпреки това, нито един модел на животни не е пълен успех при валидиране на нови терапевтични стратегии. Разработването на надеждни, възпроизводими и контролирани животински модели на мозъчно увреждане е необходимо за оценка на сложни патологични процеси.
Тук предлагаме метода на стереотаксична пункция с игла на спринцовка, който може да се комбинира с едновременно локално приложение на лекарството, като усъвършенстван модел на локални мозъчни наранявания и като инструмент за изследване на патофизиологичните последици от острата травма в мозъка на бозайниците. in vivo.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Всички представени тук процедури са извършени в съответствие с местното ръководство за грижа за животните (финландски закон за експерименти с животни 62/2006). Лиценз за животни (ESAVI/2857/04.10.03/2012) е получен от местните власти (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Възрастни мишки на възраст 1-3 месеца, с тегло 24-38 g, се държат в отделни клетки в сертифицираните животински съоръжения на университета и винаги с храна и вода ad libitum.
1. Изобразяване на мозъчна травма през черепния прозорец
2. Изобразяване на мозъчни наранявания чрез разреден череп
0,5 до 1,5 mm в диаметър. Използвайте сгъстен въздух по време на пробиването, за да отстраните костните остатъци. Извършвайте пробиването периодично по време на процедурата за разреждане, за да избегнете прегряване, причинено от триене. Охладете дозата, като използвате разтвора до стайна температура и периодично нанасяйте буфер върху изтънената област, за да абсорбира топлината.
ЗАБЕЛЕЖКА: За да избегнете повреда на кората, не пробивайте в големи области (> 1,5 мм) на тънък слой (Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
Оптимизирахме две оперативни процедури: 1) хроничен черепно-мозъчен прозорец и 2) изтъняване на черепа, чрез посттравматично изобразяване на мозъка при трансгенни мишки. Схематичен изглед на експерименталните препарати е представен в Фигура 1. Травматична пункция от 0,3 mm OD (30 g) стоманена игла се прилага върху пробитата ямка (Фигура 1А). Успешната подготовка на черепния прозорец позволява изображения на дълбочини до 650 м под повърхността на пиала (Фигура 1Б), докато изтъняването на черепа има тенденция да налага ограничение от приблизително 300 микрона (Фигура 1В), както е показано при 3D реконструкцията на кортикалните пирамидални неврони на мишка Thy1-YFP-H.
Пункционната травма води до отстраняване на дендрита и разрушаване на капилярните мрежи в контролиран обем на мозъчната кора. През първите два дни площта на нараняването се увеличава и травмата причинява дендритно обезцветяване и образуването на дендритна ретракция на луковицата в зоните на перилезия, както се наблюдава при използване на многофотонна микроскопия in vivo. (Фигура 2).
Изтъняването на черепа се извършва при активиране на изображението и миграция на микроглията при мишки CX3CR1-EGFP веднага след нараняване. (Фигура 3А). Изображенията SHG предлагат ценен инструмент за точно очертаване на мястото на нараняване (Фигура 3Б). Извънклетъчните матрични молекули, които произвеждат сигнали от групите за самопомощ, са значително обогатени в мозъчния паренхим при травма с иглени пръчки. Първо, фините микроглиални процеси се възстановяват, след което микроглиалните клетки мигрират до ръба на мястото на нараняване (Фигура 3А).
За да оценим възможните лезии, индуцирани от вмъкване на тънката стъклена пипета и доставяне на багрило, проведохме in vivo експерименти с двуфотонна микроскопия с микроинжекция на Sulforhodamine 101 в мишки Thy1-YFP-H без мозъчна травма. Представителните изображения са показани в Фигура 4 демонстрирайте кроеинжекция на миласит 3 часа след инжектирането. Следата от поставянето на пипетата може да се види в мозъчните обвивки, визуализирани от SHG (Фигура 4А). Астроцитите са маркирани със Sulphorodamine 101, въведен чрез инжектиране (Фигура 4Б). Дендритите, които експресират YFP под промотора Thy1, не демонстрират морфологични признаци на нараняване, като луковица или ретракция. (Фигура 4 ° С).
