In Utero Electroporation Подходи за изследване на възбудимостта на невроналните субпопулации и
Обобщение
Този ръкопис предоставя протоколи, които използват вътреутробна електропорация (SUI), за да опишат структурната свързаност на невроните на ниво единична клетка и възбудимостта на маркираните с флуоресценция неврони. Хистологията се използва за характеризиране на дендритни и аксонални проекции. записването на цели клетки на остри резени се използва за изследване на възбудимостта.
Резюме
Нервната система се състои от огромен набор от различни типове неврони. Тези невронални субпопулации се характеризират, наред с други характеристики, с техните отделни дендритни морфологии, техните специфични модели на аксонална свързаност и техните селективни реакции на стрелба. Молекулярните и клетъчните механизми, отговорни за тези аспекти на диференциацията по време на развитието, все още са слабо разбрани.
Тук описваме комбинираните протоколи за маркиране и характеризиране на структурна свързаност и възбудимост на кортикалните неврони. Модификацията на протокола за вътреутробна електропорация (SUI) позволява маркирането на оскъдна популация от неврони. Това от своя страна позволява идентифицирането и наблюдението на дендритите и аксоните на отделните неврони, точното характеризиране на ламинарното местоположение на аксоналните проекции и морфометричен анализ. SUI може също да се използва за изследване на промените в възбудимостта на дивия тип (WT) или генетично модифицирани неврони чрез комбиниране на остри резени с запис на цели клетки на електропорирани мозъци. Тези две техники допринасят за по-доброто разбиране на свързването на структурна и функционална свързаност и на молекулярните механизми, които контролират невроналното разнообразие по време на развитието. Тези процеси на развитие имат важни последици за аксоналното свързване, функционалното разнообразие на невроните и биологията на когнитивните разстройства.
Въведение
Развитието на дендритни и аксонални структури е важен аспект на регулирането на веригите в нервната система, включително в мозъчната кора. Той играе критична роля по време на селективното свързване на различните невронни субпопулации. Няколко скорошни доклада показват, че в допълнение към свързаността, молекулярното разнообразие на невроните се отразява и чрез придобиването на много специфични режими на стрелба. Механизмите, които определят възбудимостта и свързаността на различните невронални подтипове по време на развитието, както и тяхната степен на координация, все още са слабо разбрани. 1, 2.
Въпреки че този протокол описва електропорацията на мишки в ембрионален ден (E) 15.5, тази техника може да се извърши на всяка възраст между E9.5 и 3 дни след раждането (P) 2 4. Докато е в ранните етапи на електропорацията е насочена към неврони и предшественици на таламуса и дълбоките слоеве на кората, по-напредналият етап на електропорация маркира повече повърхностни слоеве (напр. E15.5 IUE слой II-III неврони). В обобщение, комбинацията от SUI с едноклетъчен морфологичен анализ и електрофизиология е полезен инструмент за изясняване на молекулярните механизми, лежащи в основата на огромното структурно и функционално разнообразие на невроните в нервната система.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Всички процедури за животни са одобрени от Комисията за грижа и заетост на животните в Мадрид в съответствие с националното и европейско законодателство (PROEX 118/14; PROEX 331/15). Поддържайте стерилни условия по време на процедурата.
1. Електропорация вътреутробно
ЗАБЕЛЕЖКА: Този протокол за SUI е адаптация на други, които са били публикувани по-рано 5, 6, 7. Този ръкопис описва протокол за SUI на ембриони E15.5, с модификации в репортерната стратегия, която позволява изучаването на морфологията на 8 индивида неврони и техните електрофизиологични свойства в отделен експеримент, използвайки стандартни GFP репортерни плазмиди.
2. Подготовка за операция
- Направете операция за оцеляване, като използвате асептични процедури. Гарантирайте стерилни условия, като маски, ръкавици, инструменти и хирургично поле. Стерилизирайте хирургически инструменти (скалпел, форцепс Adson, втвърдени фини ножици, извити ножици, форцепс Dumont и държач за игла).
- Изберете капиляри от боросиликатно стъкло 1/0,58 мм OD. флип капиляри 3. Ориентация за оптимална дължина на върха от 1 см след издърпване. Нарежете върха на иглата под ъгъл 30 ° с помощта на фини форцепс (Фигура 1Б).
- Пригответе 500 ml стерилен изотоничен разтвор (1x PBS или балансиран солев разтвор на Hank (HBSS)). Добавете пеницилин-стрептомицин 1: 100 и загрейте този разтвор до 37 ° C. Той може да се съхранява при 4 ° C след операцията.
- Инжектирайте подкожно предоперативна доза обезболяващи средства (напр. Карпрофен, 5 mg/kg телесно тегло).
- Поддържане на топлина на животните за операция, като ги поставите върху нагревателна подложка. Нагряване на чиста клетка до 37 ° C по време на следоперативно възстановяване.
- Анестезирайте бременна мишка C57BL/6 E15.5 с изофлуран. Първо влейте затворена камера с 3% изофлуран в 0,8 L/min кислород и оставете мишката на закрито, докато заспи. Преместете мишката в топъл компрес и поставете носа и устата в маска за доставка на изофлуран. Постепенно намалете анестезията по време на операцията до 1,5% изофлуран през маската. Потвърдете адекватната анестезия, като наблюдавате загуба на рефлекса на педала (щипка на пръста). Оптималната процедура отнема приблизително 20 минути и не повече от 45 минути.
- Нанесете очен мехлем, за да предотвратите изсъхването на очите по време на процедурата.
- Премахнете космите от област от
На 3 см от корема (с помощта на електрическа самобръсначка или крем за депилация). Измийте хирургичната зона със 70% импрегнирани с етанол памучни тампони, последвани от йод, напоен с памук. Повторете три пъти.