Фосфопротеомичният анализ идентифицира активираната отговаряща ос pi3k akt и mapk erk в клетъчната линия
- Обобщение
- Въведение
- Резултати
- Идентифициране на фосфопротеини в SNU216 и SNU216-LR клетки
- Мрежов анализ и количествено определяне на диференциално фосфорилирани протеини
- Ефекти на целевите противоракови средства върху SNU216-LR клетки
- Дискусия
- Допълнителна информация
- Файлове с изображения
- Допълнителна фигура 1
- Допълнителна фигура 2А
- Допълнителна фигура 2Б
- Допълнителна фигура 3
- Допълнителна фигура 4
- Допълнителна фигура 5
- PDF файлове
- Допълнителна таблица 1
- Допълнителна таблица 2
- Допълнителна таблица 3
- Word документи
- Допълнителна информация
Обобщение
Въведение
Рецепторът за човешки епидермален растежен фактор 2 (HER2) е една от рецепторните тирозин кинази, активирани чрез димеризация с членове на семейството на рецепторите за епидермален растежен фактор (EGFR). 1 Свръхекспресията на HER2 води до прогресия на тумора чрез вътрешноклетъчни каскади за трансдукция на сигнала 2 и се наблюдава при ~ 20-30% от рисковите случаи на рак на гърдата, 3, 4, както и при 6 -35% от инвазивните ракове на стомаха. 5 Лапатиниб инхибира пролиферацията на ракови клетки, които свръхекспресират EGFR и/или HER2 както in vitro, така и in vivo, и е одобрен от Американската администрация по храните и лекарствата като лечение за напреднал HER2-положителен рак на гърдата през 2007 г. 6,7,8 The антитуморната активност на лапатиниб също е изследвана в ракови клетки на стомаха. 9,10 Понастоящем се провежда клинично изпитване фаза III, сравняващо ефекта само на химиотерапията спрямо комбинацията с лапатиниб при пациенти с HER2-позитивен рак на стомаха. 11 Придобитата резистентност към лапатиниб обаче е била и продължава да бъде ограничение за терапевтичната му употреба в клиниката поради лошото разбиране на основните механизми.
Резултати
Идентифициране на фосфопротеини в SNU216 и SNU216-LR клетки
За да изследваме възможните механизми, отговорни за придобиване на резистентност към HER2-насочена терапия при рак на стомаха, установихме LR клетъчна линия (SNU216-LR) чрез хронично излагане на HER2-положителни клетки SNU216 (лапатиниб-свръхчувствителни ракови клетки на стомаха) на нарастващи концентрации на лапатиниб. ин витро за 8 месеца. Беше избран и характеризиран един LR клетъчен клон (SNU216-LR). Стойността на полумаксималната инхибиторна концентрация в SNU216-LR клетки е> 10 μM, което е 500 пъти по-високо от това на родителските клетки (0,02 μM).
След това извършихме мащабен количествен анализ на фосфопротеома, за да идентифицираме диференциално фосфорилирани протеини (DPP) между клетки SNU216-LR и SNU216. MS анализ на обогатени с TiO 2 фосфопептиди (протеин: вероятност> 99% и FDR 80% и FDR 20) Нашият подход идентифицира 7791 места за фосфорилиране (Ascore> 80%) сред 11 852 уникални места за фосфорилиране (Допълнителна таблица 3) Серинът беше е установено, че е най-обилно фосфорилираният остатък (9745 места, 82%), последван от треонин (1763 места, 15%) и тирозин (344 места, 3%) (допълнителна фигура 1В). Възпроизводимостта на откриването на същите протеини в три екземпляра анализът чрез LC-MS/MS надвишава 91% и за двете клетъчни линии (допълнителни фигури 1C и 1D).
За да оценим количествените промени във фосфорилирането на всеки фосфопептид, ние избрахме за DPP в клетки SNU216-LR, използвайки метода на спектрално броене на скеле (версия 3.4.9). Съотношението сигнал/шум и P-стойностите за DPP са получени с помощта на PLGEM. Списък със 95 значително регулирани фосфопротеини (P
Диференциално експресирани фосфопротеини в SNU216-LR и техните функционални анотации. ( да се ) Вулканичен график, показващ P-стойност (-log 10) спрямо съотношението сигнал/шум (S/N) на фосфопротеините, определен чрез статистически анализ на модела на глобалната грешка (PLGEM) за немаркирано количествено определяне. ( б ) Молекулярни функции на фосфопротеините, идентифицирани от инструмента за анализ на интензивността на пътя (IPA). ( ° С ) Клетъчна локализация на фосфопротеините, идентифицирани от инструмента IPA.