Доставка на вируси на ръководства CRISPR до миша простата за Протокол за генна промяна (преведено на
Обобщение
Този протокол описва нов метод за доставяне на вируса до мишата простата. Използвайки технология CRISPR/Cas9, свръхекспресия на гени или доставка на рекомбиназа Cre, техниката позволява ортотопична промяна на генната експресия и прилага нов модел на мишка за рак на простатата.
Резюме
С нарастващата честота на рак на простатата, определянето на нови туморни драйвери или модулатори е от решаващо значение. Генетично модифицираните модели на мишки (GEMM) за рак на простатата са затруднени от хетерогенността на тумора и неговата сложна динамика на микроеволюция. Традиционните миши модели на рак на простатата включват, но не се ограничават до, зародишна линия и условни нокаути, трансгенна експресия на онкогени и ксенографт модели. Генерирането на de novo мутации в тези модели е сложно, отнема много време и е скъпо. Освен това повечето традиционни модели са насочени към по-голямата част от простатния епител, докато човешкият рак на простатата е добре известен, че се развива като изолирано събитие само в малка подгрупа от клетки. Ценните модели трябва да симулират не само започване на рак на простатата, но и прогресия към напреднало заболяване.
Тук ние описваме метод за атака на някои клетки в епитела на простатата, преобразуващите клетки на вирусни частици. Доставката на вирус, насочен към мишата простата, позволява промяна на генната експресия в епитела на простатата. Количеството и видът на вируса по този начин ще определят броя на специфичните клетки за генетична промяна чрез трансдукция на някои клетки за иницииране на рак и много клетки за генна терапия. Чрез инжектиране, базирано на операция, в предния, дисталния лоб на пикочните пътища, туморът в този модел може да се разшири, без да нарушава уринарната функция на животното. Освен това, насочвайки само към подгрупа от простатни епителни клетки, техниката позволява клонално разширяване на тумора и по този начин имитира човешко започване на тумор, прогресия, както и инвазия през базалната мембрана.
Тази нова техника предлага мощен модел на рак на простатата с по-голямо физиологично значение. Страданието на животните е ограничено и тъй като не се изисква допълнително развъждане, общият брой на животните се намалява. В същото време беше ускорен анализът на новите гени и пътища-кандидати, което от своя страна е по-рентабилно.
Въведение
Откриването и лечението на рак на простатата се подобриха значително през последното десетилетие. И все пак честотата на рака на простатата се увеличава поради продължителността на живота. С приблизително 1,1 милиона нови случая в световен мащаб, това е една от най-честите причини за смърт, свързана с рак при мъжете 1. Ракът на простатата се развива бавно, но когато ракът е преминал в напреднало метастатично състояние, прогнозата е лоша поради ограничените възможности за лечение. Досега само няколко гена са идентифицирани като често срещани двигатели на този рак и тяхната хетерогенност и мултифокалност изключват откриването на биомаркери и насочени към насочване болести 2, 3 .
Класическите техники за генериране на GEMM често се влошават поради тяхната сложност, времеви и разходи. Условните модели са широко използвани за изследване на гени-кандидати за рак на простатата, които водят до ембрионална смъртност при инактивиране в зародишната линия 4. По-често срещаните модели включват специфична Cre рекомбиназа на простатата, задвижвана или от модифициран пробазин 5 или PSA 6 промотор, интегриран в GEMM чрез допълнително кръстосване. В тези модели генът, който представлява интерес, ще бъде насочен в повечето клетки на простатния епител, генерирайки хиперплазия в целия орган, която може да наруши функцията на пикочните пътища 7 на животното .
Вирусната доставка на Cre протеин чрез инжектиране в предния лоб на мишата простата може да реши този проблем, като насочи само няколко клетки 8. Вземайки предвид, методът се възползва от широк спектър от вариации на възможни технически изисквания на лабораториите, знания и цели. Успешни подходи с използване на Adenovirus за JunB и Pten 9 или Lentivirus за Pten и Trp53 10 са демонстрирани наред с други. Добавянето на трансгени, като луцифераза, вирусната конструкция или GEMM, също ще позволи неинвазивно проследяване на прогресията на заболяването чрез изображения на биолуминесценция 11 .
Редактирането на генома, базирано на технологията CRISPR/Cas9, разкрива нова и бърза възможност за изследване на рака чрез бързото генериране на соматични нокаути 12. Вирусното доставяне на единични водещи РНК (sgRNAs), насочени към предния лоб на мишата простата, установява по-подходящ физиологичен модел на рак на простатата. По този начин клетките с поискани мутации могат да образуват клонинги, способни на експанзия и инвазия. В допълнение, използването на насочващи РНК за различни целеви гени ще генерира клетъчни клонинги с промени в различни гени. Това ще позволи хетерогенност на тумора и естествен селекционен натиск върху прогресията на рака, което може да разкрие важността на всяка промяна на гени или епистатични механизми.