ДИАГНОСТ; СТИКО НА Helicobacter spp
Одобрение: 11 октомври 2017 г.
Ключови думи: Стомах, гастроскопия, дихателен тест, язва.
Резюме: Язвеният стомашен синдром на конете (EGUS) е многофакторна единица, която произвежда стомашни лезии на лигавицата. EGUS е бил свързан с рискови фактори, като нас стабилизация, снабдяване със зърно, хипергастринемия поради упражнения, стрес, нестероидни противовъзпалителни лекарства (НСПВС) и дисбиоза (Helicobacter spp.). Целта на това проучване е да се открие Helicobacter spp. върху стомашната лигавица на еднокопитни и за определяне на връзката му с EGUS. Бяха оценени 20 коня с различни породи, и двата пола, конюшни. Извършена е езофагус-гастро-дуоденоскопия и биопсия на лигавицата на жлезата. Пробите бяха подадени на бърз тест за уреаза (URT) и в изследваната популация беше извършен тест за дишане на урея (UBT). Бяха разработени описателна статистика и тест за чувствителност/специфичност. Тестовете за производство на уреаза са по-малко чувствителни по отношение на теста за „златен стандарт“ (урея агар); Не беше възможно да се определи съответствието между тестовете за уреаза и наличието на Helicobacter spp или EGUS. Не беше определено съответствие между тестовете и EGUS или Helicobacter spp., Изисква молекулярна диагностика.
Ключови думи: Стомах, гастроскопия, дихателен тест на урея, язва.
Helicobacter е Грам отрицателна, микроаерофилна, спирална, бичевидна бактерия, първоначално класифицирана в рода Campylobacter, но прекатегоризирана през 1989 г. [14], благодарение на подробното изследване на микроорганизъм, открит в пилорния антрум на хора със стомашно заболяване, наречен оттогава Helicobacter pylori. Въпреки че най-известната му форма е спиралата, тя е плеоморфна. Сферичните форми (кокоиди) се появяват при условия на лишаване от хранителни вещества, излагане на антибиотици или продължително време на инкубация. Предполага се, че тези форми се връщат към бациларното представяне в съответствие със специални условия на околната среда, връщайки своята инфекциозна способност [1, 14].
Най-известният биохимичен профил сред рода Helicobacter е този на H. pylori, чиято най-забележима ензимна активност е способността да хидролизира урея, както и да има алкална фосфатаза, оксидаза и каталазна активност. Въпреки че активността на уреазата се счита за относително често срещана сред хеликобактерните видове, някои от тези бактерии, открити в стомашната лигавица на животните, се различават по своята ензимна активност и въздействие върху тъканите.
Някои микроорганизми, открити в стомашната лигавица на еднокопитни животни (Equus ferus caballus), както здрави, така и улцерирани, са свързани с рода Helicobacter [3, 7, 8, 16], сред тях H. equorum [12]; Въпреки това, участието на Helicobacter в патогенезата на стомашен улцерозен синдром на конете (EGG) все още не е установено, въпреки че съществува презумпцията, че присъствието му в стомашната лигавица на конете е потенциален рисков фактор за въпросния синдром. Поради тази причина настоящото проучване има за цел да открие бактериите чрез тестове за активност на уреазата, в допълнение към установяване на връзката между SUGE и неговото присъствие.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Вид на обучението и етични аспекти
Беше проведено описателно, проспективно проучване с напречно сечение чрез вземане на проби. Изследването е одобрено от Институционалния комитет за грижа и използване на животните от Университета в Антиокия чрез протокол 3082013.
Езофагус - гастро - дуоденоскопия
Проведена е гастродуоденоскопия, след гладуване в продължение на дванадесет и четири часа (h), съответно за твърда и течна храна. Проведена е седация с 10% ксилазин (Anased®, Lloyd Laboratories, Айова, САЩ) (0,5 mg/kg/IV). Впоследствие е извършена ендоскопия с използване на система за видео ендоскоп (PortaScope®, 1800PVS, Bradenton, FL, USA). Макроскопските находки са класифицирани според класификационната скала на степента на стомашни лезии, предложена от MacAllister et al. [единадесет].
По време на обиколката на ендоскопа се накапва вода за подобряване на визуализацията на стомашната лигавица. След като беше извършена гастроскопската оценка и класификация на лезиите, бяха взети три биопсии от стомашната повърхност, лигавицата на жлезата (фундуса) и пилорния антрал, чрез поставяне на гъвкав транс-ендоскопски форцепс (PortaScope®, 1800PVS, Bradenton, FL, САЩ), за извършване на бързи тестове за уреаза (PRU).
Бърз тест за уреаза (PRU)
За провеждане на PRU се приготвя модифициран бульон от карбамид [13], съставен от 500 ml дестилирана вода; 100% урея (Merck, Дарнщат, Германия) 10g; фенолно червено 0,005g; 97% солна киселина 0,2 ml; полученото рН е 7, измерено през индикаторна лента за рН. Бульонът се разпределя в аликвотни части в 0,5 ml обеми и се депозира в 2 ml криовиали, всяка взета биопсия се потапя напълно в бульона и се етикетира. Пробите в бульона се инкубират при стайна температура в продължение на 12 часа за по-късно отчитане.
Реакцията на уреазата се основава на наличието на среда, богата на урея, която също съдържа индикатор за рН (фенолно червено). Когато източникът на ензима уреаза беше потопен (в този случай микроорганизми с уреазна активност), той отговаряше за хидролизата на уреята, присъстваща в средата; Освобождаването на амоний и въглероден диоксид в резултат на реакцията направи средата алкална и предизвика промяна на цвета от жълта (отрицателна) до интензивна червена фуксия, което показва положителна реакция на уреазната активност (ФИГ. 1).
Двадесет проби от жлезиста лигавица бяха взети в два екземпляра, за да бъдат подложени на карбамиден бульон и карбамиден агар ("златен тест"), използвани в лабораторията за ветеринарна микробиология на Факултета по аграрни науки на Университета в Антиокия, за да се потвърди резултатът между двете медии. Карбамидният агар е съставен от основен гел (Urea agar Base Christensen® Merck Millipore, MA, САЩ) 3,6 g, карбамидна сол (Carlo Erba Reagents SAS, Chaussée du Vexin, FR) 7,5 g и 5 капки 97% солна киселина . За да се потвърди ефективността на бульона, се използва инокулум на микроорганизъм с положителна уреазна активност (Proteus spp.).
Тест за дишане (Тест за дишане на урея - UBT)
Базалният дъх на всяко еднокопитно се взима, като се вкарва стъклена тръба (Exetainer® флакон за тестване на дишането 13C, Labco limited, Обединено кралство) в ноздра, докато контралатералната едновременно се запушва, когато еднокопитното изтича, тръбата се затваря незабавно. Впоследствие на всеки индивид бяха дадени 50 mg C13 урея (партида U23001), разредени в 5 ml вода и приложени директно срещу стомашната лигавица през работния канал на ендоскопската сонда. След това, 10 минути след подаване на реагента, се вдишва второ (издишване) в друга стъклена бутилка. Всяка епруветка беше отчетена на масспектрометър с изотопно съотношение (ABCA2 Automated Breath CO2 Analyzer, Sercon® limited, UK). Резултатът, който доказва съотношение на газ, по-голямо от 2Δ (делта), се счита за положителен. Очакваната химическа реакция е представена в следното уравнение: 13 CO (NH2) + H2O → 2 NH 3 + 13 CO2
Статистически анализ (чувствителност и специфичност на диагностичните тестове)
За да се определи способността на диагностичните тестове да откриват истински положителни уреазни реакции, беше направено сравнение на ROC кривите (крива на характеристика на работната характеристика на приемника) между PRU, UBT и карбамиден агар („златен тест“). Този анализ е извършен със софтуера EPIDAT® V 3.1.
РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ
Няма значително разстояние между стандартната линия (диагонал) и оценените криви PRU и UBT (ФИГ. 2), което показва, че резултатите се дължат на случайността, а не на съответствието със златния тест (Ji тест 2 = 0,1728; P стойност = 0,6777). Анализът на ROC кривата показа, че нито PRU, нито UBT са чувствителни за откриване на уреазна активност (ТАБЛИЦА I) в сравнение със златния тест.