Създаване на двойния хуманизиран модел на мишка TK-NOG за свързана с ХИВ чернодробна патогенеза

Обобщение

Този протокол предоставя надежден метод за установяване на хуманизирани мишки с човешката имунна система и чернодробни клетки. Възстановените двойни имунодефицитни мишки, постигнати чрез интраслезивна инжекция на човешки хепатоцити и CD34 + хематопоетични стволови клетки, са податливи на инфекция с човешки имунодефицитен вирус-1 и рекапитулирани чернодробни увреждания, наблюдавани при пациенти, заразени с ХИВ.

Резюме

Въведение

От появата на антиретровирусната терапия се наблюдава значително намаляване на смъртните случаи, свързани с ХИВ-1 моноинфекция. Въпреки това, чернодробното заболяване се очертава като честа причина за заболеваемост при ХИВ-инфектирани пациенти 1, 2. Ко-инфекциите с вируса на хепатит с HIV-1 инфекция са по-чести, като представляват между 10% и 30% от заразените с ХИВ хора в САЩ 3, 4, 5 .

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Този протокол е одобрен от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните (IACUC) към Медицинския център на Университета в Небраска.

ЗАБЕЛЕЖКА: Получете одобрение от местната IACUC, преди да провеждате опити с животни.

1. Обработка на кръв от пъпна връв и изолиране на шумано HSpC

2. Подготовка на човешки хепатоцити за трансплантация

  1. Отстранете криоконсервираните хепатоцити от течен азот, бързо потопете флакона във водната баня и размразете за около 90 - 120 s.
  2. Отстранете капачката от флакона и изсипете размразените хепатоцити в 50 ml конична тръба с нагрята размразяваща среда.
  3. Суспендирайте клетките, като разклатите тръбата от 50 ml на ръка за няколко секунди.
    ЗАБЕЛЕЖКА: Не завихряйте тръбата.
  4. Отблъсквайте клетките при 100 х g за 8 минути при стайна температура. Измийте гранулираните клетки в PBS с 0,1% BSA и разклатете с пресен или размразен HSCC (съотношение 10: 1) в PBS в краен обем от 80 μl/мишка.

3. Управление на животни, скрининг, генотипизиране и лечение на човешки hSPC и трансплантация на хепатоцити

4. Валидиране на човешкия чернодробен трансплантат чрез ELISA и човешката имунна система чрез поточна цитометрия

ЗАБЕЛЕЖКА: Оценявайте възстановяването на човешкия черен дроб и имунната система ежемесечно, започвайки 1 месец след трансплантация чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и съответно поточна цитометрия.

5. ХИВ инфекция на мишки TK-NOG и нейният ефект върху черния дроб и имунната система на човека

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

двойния

Фигура 1 : Схема на обогатяване на CD34 + клетки от кръв от пъпна връв. (ДА СЕ) Кръвната връв се наслоява в среда за отделяне на лимфоцити (LSM) и се центрофугира, за да се изолира буфистният слой. (Б.) LS колоните се поставят върху магнитна стойка и се изплакват с BSA буфер, последвано от добавяне на слой buffy. Клетките, положителни за CD34, се улавят в колоните и CD34 клетките се елуират в отделни епруветки. CD34 + клетките, уловени в колонови смоли, се потапят и клетките се събират в нова епруветка. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 4 : Концентрацията на албумин се измерва чрез ELISA в серума на двойни човешки мишки. Мишките се трансплантират с човешки хепатоцити (HEP) и CD34 + стволови/прогениторни хематопоетични клетки (HSPC) (# 11). Серумът се събира по различно време на 1, 4 и 6 месеца след трансплантацията и се правят разреждания, за да се коригират неизвестни концентрации на пробата в диапазона от стандарти. Всеки символ представлява индивидуална стойност на мишката. Резултатите представят медианата, както и индивидуалните стойности. * Р 8. Щракнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.