Протеин за съхранение на глобулин от зърнени храни с ниско съдържание на протеин

Субекти

Обобщение

Въведение

Материали и методи

Пациенти и серуми

Протеинови екстракции

Общо протеини от 50 mg-s бяха извлечени от чисто настъргани семена от B. distachyon линия Bd21, следвайки протокола на Dupont et al.13. Накратко, SDS-Tris екстракционен буфер (pH 6.8), съдържащ 2% SDS, 10% глицерол, 50 mM DTT и 40 mM Tris-HCl, pH 6.8, беше използван за извличане на общия протеин при стайна температура в продължение на един час с редовно слабо доза. вихър. Екстрактът се центрофугира при 16000 g в продължение на 15 минути. Супернатантата се утаява с четири обема ледено студен ацетон. В процеса на екстракция са използвани пет биологични копия.

2D гел електрофореза и имуноблотинг

След утаяване, гранулата се разтваря с IEF буфер (8М карбамид, 2% CHAPS, 100 тМ DTT, 0.2% СА и 0.1% бромофенолно синьо). Изоелектричното фокусиране се извършва в Immobiline DryStrips pH 7-10 от 7 cm (GE Healthcare), при условия на рехидратация за една нощ с 200 µg протеин в 150 µl IEF буфер. 12% полиакриламидни гелове бяха използвани за разделяне на протеините според тяхното молекулно тегло. 2D GE беше извършен в три технически реплики. Тъй като всички 2D протеинови модели от различните биологични и технически реплики бяха идентични, крайният вграден нано-LC-MS/MS беше извършен от три 2D GE технически реплики и петната бяха обединени.

След като GE 2D протеините бяха прехвърлени в ImmobilonP PVDF мембрана (Millipore, Billerica, USA) и блокирани за 1 час с 5% BSA и 0,05% TWEEN20, последвано от инкубация през нощта при 4 ° C с 1:20 разредени кръвни серуми. Имунореактивни протеини бяха открити с козе анти-човешко IgA пероксидазно конюгирано антитяло (Sigma-Aldrich-A0295) в присъствието на хромогенен пероксидазен субстрат 4-хлоро-1-нафтол. Протеиновите петна с имунен отговор бяха изрязани и изпратени за идентифициране на протеини, използвайки онлайн nano-LC-MS/MS. Оризово глутелиново антитяло заедно с анти-заешки IgA като вторично антитяло се използва в 2D Western blot анализ, за ​​да се потвърди наличието на глобулини за съхранение на семена 14 .

Идентификация на протеини чрез нано-LC-MS/MS онлайн

Анализ на последователността и епитопни прогнози

Резултати

глобулин

( ДА СЕ ) - 2D гел електрофореза на общия протеинов екстракт от инбредната линия Bd21. Протеините се разделят на 3-10 pH IPG ленти, последвани от разделяне на 12% акриламидни гелове. Маркираните протеинови петна представляват имунореактивни протеини и са представени за онлайн nanoLC-MS/MS анализ. Диапазонът на молекулното тегло е маркиран от лявата страна. ( Б. да се F ) - представителни имуноблоти, използващи IgA-реактивни серуми от наивни пациенти с целиакия ( Б. - HLA DQ2, ° С - HLA DQ8, д - HLA DQ8/X), терапия, засегната от илеоколичен пациент с болест на Crohn ( И ), Пациент с целиакия HLA DQ2 с безглутенова диета и здравословен контрол ( G ). З.: Извършен е Western blot анализ на общия протеинов екстракт с използване на оризов глутелин 12 и анти-заешки IgA (Sigma-Aldrich) антитела като вторично антитяло.

Изображение в пълен размер

Таблица в пълен размер

Две 7S глобулини (Uniprot ID I1GPS5 и I1GMC8) бяха предимно идентифицирани от петната. I1GPS5 беше признат за основен хит от 14 протеинови точки. Този протеин показва най-голямо сходство с хомолозите на пшеничния протеин за съхранение Globulin-3 и Globulin-3A (Uniprot ID B7U6L4 и I6QQ39). I1GMC8 е идентифициран в две протеинови петна и показва най-голямо сходство на последователността с глобулин 1S-подобен протеин, идентифициран от Triticum urartu (M7ZQM3). Брахиподиевият протеин на I1HNH9 показва най-висока хомология с 11S глобулин (A. sativa Q38780). Протеините I1HMK7 и I1IPF2 бяха идентифицирани като 12S глобулини, с най-силно сходство с 12S протеините за съхранение на семена в A. sativa (P12615 и P14812). Sera реагира по-често на хомолога на пшеничния протеин за съхранение Globulin-3A (69,23% - I1GPS5) и глобулините тип 11S и 12S (76,92% - I1HNH9 и I1HMK7). Подобен хомолог на глутенин с ниско молекулно тегло (69,23% I1HMR6) също е силно реактивен имунитет към серумите на пациенти с целиакия.