КОНТРОЛ ЗА КАЧЕСТВО НА АКВАКУЛТУРНИ ВХОДИ И ДИЕТИ
За:
Хуан Карлос Медина Б.
Елиезер Кастило
Въведение
Микотоксините са вторични метаболити с ниско молекулно тегло, произведени от гъбички, които причиняват патологични ефекти при хора и животни.
14.2. Разработване на имунохимични методи
Тъй като микотоксините не са антигенни, първите проучвания, които бяха разработени, бяха в смисъл да се постигне конюгация с протеини или полипептиди, които биха могли да служат като транспортери в оптималните условия за производство на антитела при зайци и други животни. С напредъка в технологията са произведени моноклонални антитела срещу различни микотоксини. Това развитие се е увеличило през последните 8 години. В таблица 14.1. представено е настоящото съотношение на наличните микотоксинови антитела.
Както може да се очаква, са разработени различни видове имуноанализи, сред които се открояват ELISA (ензимно-свързани имуноанализи), RIA (радиоимуноанализи) и имуноафинитетни колони. Повечето от тези методи са много чувствителни, специфични и лесни за работа. С което се появи измерение по отношение на методологията за анализ на микотоксините.
Преди да пристъпим към обсъждането на различните видове имуноанализи, трябва да вземем предвид следното:
Тъй като повечето имуноанализи се основават на конкуренция за местата на свързване на молекулите на антителата между токсините, присъстващи в пробата, и маркираните токсини, характерни за системата, конюгирани микотоксини. Следователно е необходимо да имате перфектно маркиран микотоксин в допълнение към специфичното антитяло в системата за анализ.
Необходимо е да има добър метод за извличане на микотоксини и адекватна процедура за разделяне на свързани и свободни токсини.
Трябва да се знае степента на специфичност на антителата, омрежващи, срещу аналогични съединения.
Тъй като винаги има възможност даден компонент на пробата да реагира с антителата, е необходимо да се проучи подробно всеки тип матрица, преди да се извършат съответните тестове.
Процедурите за почистване на екстракти не са необходими за повечето системи за имуноанализ. По такъв начин, че екстрактът от твърдата матрица да може да се използва директно в теста, след разреждане с буферен разтвор, характерен за самата система. Чувствителността на определянията обаче се увеличава, когато се използва адекватна процедура за почистване на екстрактите.
| Афлатоксини: B1, B2, G1 | Моят P |
| Афлатоксинови метаболити B2a, Q1, M1, Ro | Моят P |
| Циклопиазонова киселина | P |
| Ерготамин | P |
| Фузарохроманон | P |
| Фумонизин | М |
| Кожикова киселина | P |
| Охратоксин А | Моят P |
| PR токсин | P |
| Рубратоксин В | P |
| Секалонова киселина | P |
| Стеригматоцистин | P |
| Трихотецени: DAS, DON, FX, DOVE, NIV, T-2 и техните метаболити | Моят P |
| Зеараленон | Моят P |
| Патулин | P |
Източник: Чу, 1992 г.
14.2.1 Радиоимуноанализи (RIA)
Процедурата за радиоимуноанализ включва инкубацията на специфично антитяло едновременно с разтвор на проба или стандартен разтвор с известна концентрация и постоянно количество белязан токсин. След разделяне на свободните и свързани токсини, радиоактивността се определя във всяка от тези фракции.
Концентрацията на токсина в пробата се определя чрез сравняването й със стандартна крива, която се установява чрез нанасяне на съотношението на радиоактивността в свързаната фракция и свободната фракция спрямо логаритъма на концентрацията на немаркираните токсини.
Чувствителността на този тип анализ за микотоксини е обобщена в таблица 14.2, но като цяло този имуноанализ може да открие 0.25 до 0.5 ng от пречистения токсин. В случай на проби от храна, границите на откриване са от 2 до 5 ppb. Тази чувствителност може да се подобри с някаква процедура за почистване на екстрактите или чрез използване на радиоактивни маркери с висока активност, като микотоксини, маркирани със 125 I. Въпреки че тази техника е инструмент, който осигурява точни резултати, методът включва използването на радиоактивност, следователно използва се изключително в изследователски лаборатории и в някои промишлени съоръжения.
| AFB/AF | Царевица, пшеница, фъстъци | 1 - 10 |
| Афлатоксин М | Мляко | 0,01 |
| Деоксиниваленол | Царевица, пшеница | 300 |
| Охратоксин А | Царевица, пшеница | 5 |
| Токсин Т - 2 | Царевица, пшеница | 2,5 - 50 |
| Зеараленон | Царевица | 100 |
Източник: Чу, 1992 г.
14.2.2 Ензимно-свързани конкурентни имуноанализи (ELISA)
По принцип системата ELISA е приблизително 10 до 100 пъти по-чувствителна от радиоимунологичните тестове за пречистени микотоксини. Възможност за откриване на стойности до 2,5 pg чисти микотоксини.
Настоящото развитие на тези ELISA системи позволява определянето на афлатоксин, Т-2 токсин или дезоксиниваленол да се извършва за по-малко от един час след процеса на екстракция. Чувствителността на ELISA системата се подобрява, когато се извършват процеси за пречистване на екстракти. Чувствителността на ELISA системите е специфична за всеки микотоксин, Таблица 14.2. представя връзка за тази информация.
В индиректния ELISA анализ конюгат, образуван от микотоксина, свързан с протеин или полипептид, се имобилизира върху микротитърна плака. Плаката се инкубира със специфичното антитяло в присъствието и отсъствието на хомоложните микотоксини. След това количеството антитяло, свързано с протеиновия конюгат, имобилизиран върху плаката, се определя чрез реакция с IgG ензимен комплекс, който се предлага на пазара, и последваща реакция със субстрата. По този начин токсинът в пробите и токсинът в твърдата фаза се конкурират за едни и същи места на свързване със специфичното антитяло в разтвор.