Изследване на in vivo метаболизма на глюкозата при диети, хранени с високо съдържание на мазнини, използващи тест за толерантност към орална глюкоза

Обобщение

Настоящата статия описва генерирането и метаболитната характеристика на мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, като модел на индуцирана от диетата инсулинова резистентност и затлъстяване. Също така има подробни протоколи за извършване на орален глюкозен толеранс и инсулинов толеранс, мониторинг на цялото тяло, промени в метаболизма на глюкозата in vivo.

изследване

Резюме

Въведение

В развитите страни затлъстяването и диабетът достигнаха епидемични измерения поради физическо бездействие и прекомерна консумация на преработени храни, последици от бързата урбанизация, индустриализацията и глобализацията. Въпреки че изследванията върху инсулиновата резистентност и нейните съпътстващи заболявания, като хиперлипидемия и атеросклероза, придобиват голямо значение през последните десетилетия, сложните биологични механизми, които регулират метаболизма в здравето и заболяванията, остават неразбираеми и все още има спешна нужда от нови начини на лечение за предотвратяване и лечение тези заболявания 1 .

Инсулинът и неговите контрарегулаторни хормони глюкагон служат като основни регулатори на клетъчното енергийно снабдяване и баланса на макроелементите, като по този начин поддържат адекватни системни концентрации на глюкоза в кръвта 2. Самата глюкоза действа като един от основните стимулатори на секрецията на инсулин от β-клетките на панкреаса, докато други макронутриенти, хуморални фактори като невронни входове допълнително модифицират този отговор. Следователно инсулинът задейства анаболните процеси в храненото състояние, като улеснява дифузията на излишната кръвна глюкоза в мускулните и мастните клетки и допълнително активира гликолизата, както и синтеза на протеини или мастни киселини, съответно. Освен това инсулинът потиска отделянето на чернодробна глюкоза чрез инхибиране на глюконеогенезата. Хроничната излишна консумация на енергия и мета-възпалението водят до хиперинсулинемия и периферна инсулинова резистентност поради понижаване на експресията на инсулиновия рецептор, както и промени в сигналните пътища надолу по веригата, което води до нарушена чувствителност към медиирано от инсулин изхвърляне на глюкоза, както и недостатъчно инхибиране на производството на чернодробна глюкоза 3, 4, 5, 6 .

Широка гама от животински модели с генетична, хранителна или експериментална индукция на болестта се оказаха отлични инструменти за изследване на молекулярните механизми на инсулинова резистентност и различни форми на диабет, както и придружаващите го заболявания 7. Пример за това е широко използваният и утвърден HFD-индуциран модел на мишка, който се характеризира с бързо увеличаване на теглото поради увеличен хранителен прием в комбинация с по-ниска метаболитна ефективност, което води до инсулинова резистентност 8, 9. Както при животински, така и при човешки модели, повишаването на нивата на кръвната захар и инсулин на гладно, както и нарушената толерантност към прилагането на глюкоза се използват като показатели за инсулинова резистентност и други системни нарушения на метаболизма на глюкозата. Проследяването на нивата на глюкоза и инсулин в кръвта на изходно ниво или след стимул е лесно достъпно отчитане.

Като цяло, ние предлагаме прост протокол за генериране на HFD-индуциран модел на мишка, като същевременно описваме по-нататък два мощни подхода за изследване на метаболитните нарушения в цялото тяло, САЩ и ITT, които могат да бъдат полезни инструменти за изследване на патогенезата на заболяване и разработването на нови терапии, особено в областта на заболявания, свързани с метаболизма като инсулинова резистентност и диабет.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички методи, описани тук, са одобрени от Грижата за животните и използването на Виенския медицински университет и се извършват съгласно Федерацията на европейските лабораторни асоциации за научни животни (персонал). Моля, обърнете внимание, че всички процедури, описани в този протокол, трябва да се извършват само след одобрение от институцията и правителството, както и от персонал, който е технически компетентен.

1. HFD-хранени мишки

Забележка: Поддържайте всички мишки C57BL/6J на 12-часов цикъл светлина/тъмнина със свободен достъп до храна и вода.

  1. На 6-седмична възраст мишките поставят за 8-12 седмици HFD (40-60% калории от мазнини), за да предизвикат затлъстяване, като същевременно хранят слабата контролна група с нискомаслена диета (LFD) (10% калории от мазнини).
  2. Седмично определяйте телесното тегло на мишките. Кривите на теглото трябва да показват сходни модели и в двете групи, с по-голям наклон в групата, захранвана с HFD.

Забележка: Ако точките за вземане на кръвни проби са избрани по време на OGTT на всеки 15 минути, експериментът трябва да се извърши с максимум 15 мишки паралелно, за да има поне 1 минута време за работа на мишка.

Забележка: Същите предпазни мерки, описани за OGTT (боравене с мишки, кръв, глюкомер и използване на вазелин) също трябва да се прилагат при извършване на ITT. Например, всички инжекции трябва да се извършват в рамките на 15 минути на интервали от 1 минута, ако паралелно се тестват 15 мишки. За ITT последващото събиране на кръвни проби с капилярни епруветки не е задължително.

10 минути при мишки 13, крайните разлики след приложението на инсулин (например след 2 часа) не могат да отразяват директен ефект от действието на инсулина. Прилагайте 20% разтвор на глюкоза в случай на хипогликемична мишка (нива под 35 mg/dL глюкоза в кръвта) и има риск от смърт.

  • След последните точки, поставете мишките в домашните им клетки, приготвени с много храна и вода.

    • Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    Фиг. 1 показва график за метаболитно фенотипизиране на мишки на диета. На възраст около 6 седмици, мишките трябва да бъдат поставени в HFD, докато групата с LFD може да служи като контролна група. Важното е, че телесното тегло трябва да се определя ежеседмично, за да се види дали има очаквано нарастване на телесното тегло. Всеки тип стрес (напр. Шум или агресивно поведение от мъжки пол) може да попречи на увеличаването на телесното тегло и трябва да се елиминира незабавно. Всяка кохорта от мишки за диетичните експерименти трябва да се състои от поне 10 мишки, тъй като тези диетични експерименти са бавни и цъфтежът е чест (напр. Мишки, които не наддават на тегло или мишки с необичайни нива на глюкоза или инсулин). След избрания период от време (в зависимост от хипотезата на изследването и времето на очакваните промени), OGTT и ITT могат да се извършват за оценка на инсулиновото действие и глюкозния толеранс. В тази работа бяха избрани последни моменти за метаболитния тест.