Генетично кодиране на неканонична аминокиселина за генериране на конюгати от антитела и лекарства
Обобщение
Включването на антитяло, получен от лизин циклопропен, позволява специфично, бързо и ефективно свързване на молекули, носещи тетразин, за генериране на конюгирани лекарства за антитела.
Резюме
Въведение
Конюгатите антитяло-лекарство (ADC) съчетават селективността на биотерапевтиците и силата на малките цитотоксични молекули. Повечето ADC твърдят, че намаляват страничните ефекти на традиционната химиотерапия чрез насочване към лекарства, които влияят на полимеризацията на ДНК или микротубулите на раковите клетки 1. ADC от първо поколение, одобрени от Администрацията по храните и лекарствата (FDA), се основават на модификацията на лизини и цистеини, която генерира смеси от модифицирани молекули в различни позиции с намалени фармакокинетични свойства 2. Напротив, специфичното конюгиране на лекарства за антитела може да генерира съединения с по-добри терапевтични показатели 3, 4. Опитвайки се да се справи с предизвикателството да произвежда хомогенни ADC, са докладвани няколко селективни химически и ензимни модификации 1, 5. Съвременните методи обаче могат да насочват само към определена позиция върху антитялото, да страдат от ниска експресия на протеин, да осигуряват линкери с ниска стабилност или да разчитат на бавни реакции и нисък добив.
Включването на неканонични аминокиселини (ncAA) чрез разширяване на генетичния код позволява специфичното за мястото инсталиране на множество реактивни биоортогонални групи в протеини, потенциално преодоляване на ограниченията на други методи, използвани за генериране на ADC. Кодирането на ncAA в отговор на прицелен (стоп) кодон се основава на двойки аминоацил-тРНК синтетаза/тРНК, които са ортогонални на ендогенни двойки, които включват 6 канонични аминокиселини. Няколко NcAA са включени в антитела за генериране на ADC. Въпреки това, различни задължения страдат повече за приложения в конюгирането на терапевтични лекарства. p-ацетилфенилаланин (pAcF) 7, 8 не е напълно биоортогонален, изисква ниско рН (4,5) и дълги времена на реакция (> 60 часа), докато азиди като p-азидофенилаланин (pAzF) 7, 9, 10, p- азидометилфенилаланин (обръщане) 11 и производно на лизин азид (AzK) 12, 13 могат да бъдат редуцирани в клетка 14, а медта, използвана за катализиране на активността на Huisgen, може да предизвика окислително увреждане 15 .
Въпреки че алтернативните ncAAs-циклооктен (TCO), циклооктин (SCO) и бицикло [6.1.0] нонен (BCN), базирани на транспорт, са наскоро кодирани в антитяло за целите на биоизобразяването, експресионната система страда от много ниски добиви (0,5 mg/L) 16. От друга страна, циклооктените и циклооктините са големи и хидрофобни дръжки, които могат да увеличат податливостта на ADC към полезни натоварвания - ADC за агрегиране традиционно са хидрофобни и физикохимичните свойства на машината за колбаси показват висок индекс на фармакокинетично и терапевтично въздействие 17. За разлика от тях, 1,3-заместените циклопропени са малки реактивни групи, които трябва да причинят минимални промени в структурата на протеините и физикохимичните свойства 18. Циклопропените селективно и бързо реагират с тетразини чрез циклопридаване на Дилс-Алдер на обратното електронно търсене 19. В този протокол използваме производно на лизин (CypK, Фигура 1b) метил циклопропен, който е по-малко засегнат от стерично препятствие от по-големите филтрирани ненаситени пръстени и има константа на скоростта на реакция от порядъка на 1-30 M -1 s -1 във водна среда 18, 20 .
Наскоро той ни информира как да включим CypK в антитела, за да генерираме ADC, като реагираме на този биоортогонален минимален вал с молекули, носещи тетразин 21. Тук описваме по-подробно процедурата за подготовка на ADC с акцент върху по-трудните стъпки. Включването на CypK е насочено с двойка пиролизил-тРНК синтетаза (PylRS)/tRNACUA (PylT) в отговор на кехлибарен кодон, въведен в тежката верига на антитялото (HC) 22. Тук използваме два плазмида за преходна трансфекция (Фигура 1а), кодираща тежката верига на антитялото и другата, кодираща леката верига (LC), и двете съдържащи касетата PylRS/PylT. Алтернативно, стабилна клетъчна линия, която позволява по-високи добиви на антитялото, може да бъде генерирана чрез по-трудоемка процедура. .
Горните експресионни системи могат да произвеждат терапевтичен анти-HER2 имуноглобулин 1 (IgG1) трастузумаб с CypK на нива, подобни на антитела от див тип. Избрахме първата позиция CH1 домейна на тежката верига за кодиране на ncAA (HC-118TAG). Това е най-често модифицираният сайт в ADC 23 и е известен като HC-118 (изброяване на ЕС), но също така е известен като HC-121 (позиция на последователността) и HC-114 (изброяване на Кабат) 24. Тъй като тази позиция се запазва по време на IgG1, тези експресионни системи трябва да бъдат податливи на най-много терапевтични антитела.
Ние показваме, че трастузумаб (CypK) 2 може лесно да бъде пречистен от протеин А, последван от бърза протеинова течна хроматография с колона за хидрофобно взаимодействие (HIC-FPLC). Впоследствие антитялото е ковалентно в рамките на 3 часа към инхибитора на полимеризацията на микротубулите монометил ауристатин Е (MMAE), който се използва в одобрения от FDA Adcetris ADC. Тук използваме бензилово производно тетразин ММАЕ (тетразин-vcMMAE) с линкер, съдържащ глутарен дистанционер и лабилен компонент на валин-цитрулин протеаза, последван от самоизолираща p-аминобензилалкохолна единица; Този линкер се разцепва от катепсин В в лизозомата при интернализация на ADC, което води до освобождаване на токсин 25, без да оставя следи. За да се демонстрира амплитудата на реакцията, че антитялото е свързано и с флуорофорния тетраметилродамин (TAMRA). Обясняваме как да проверим идентичността на конюгата чрез течна хроматография, свързана с масспектрометрия (LC-MS) и да изчислим съотношението лекарство-антитяло (DAR) чрез високоефективна течна хроматография с колона за хидрофобно взаимодействие (HIC-HPLC) .