Ефекти на екзендин-4 върху пролиферацията на стволови клетки, миграцията и апоптозата
Субекти
Обобщение
Въведение
Exendin-4 (Ex-4), ново антидиабетно средство, изолирано от слюнчените жлези на чудовището Gila, споделя 53% хомология с човешкия глюкагоноподобен пептид-1 (GLP-1) и е предназначен основно за подобряване на контрола на глюкозата чрез въздействие върху глюкагоноподобния пептид-1 рецептор (GLP-1) (GLP-1R) 16. Изследователите обаче наскоро откриха, че Ex-4 също насърчава разпространението или оцеляването на много клетъчни типове 17, 18 чрез GLP-1R-зависими и независими 19, 20 пътища. Налице е обаче малко информация за ефектите на Ex-4 върху биологичните функции на MSC. В това проучване наблюдавахме благоприятните ефекти на Ex-4 върху разпространението на MSC, миграцията и оцеляването. След това изследвахме дали модулаторната функция на Ex-4 в MSC се дължи на активирането на сигналния път PI3K/Akt.
Материали и методи
Декларация за етика
Настоящото проучване беше проведено в съответствие с Декларацията от Хелзинки и насоките на Комитета по етика на Общата болница на Китайската армия за свобода (Пекин, Китай). Всички експериментални протоколи бяха одобрени от Комитета по етика на Общата болница на Армията на народната свобода в Пекин (Китай).
Изолиране, култивиране и идентификация на MSC костен мозък.
MSC се изолира от костния мозък и се събира, както е описано по-горе. Накратко, пробите от костен мозък на плъх Sprague-Dawley се разреждат с PBS и се центрофугират при 400 х g за 30 минути. Козината, съдържаща мононуклеарни клетки, се промива два пъти с PBS и се посява в MSC културна среда, състояща се от модифицирана среда на орел на Dulbecco (DMEM; Invitrogen Co., USA) с L-глутамин и 10% (v/v) фетален говежди серум (FBS) ). Културите се държат при 37 ° С във влажна атмосфера, съдържаща 5% въглероден диоксид. След 24 часа неприлепналите клетки се изхвърлят и се добавя прясна среда и се заменя на всеки 4 дни. Всяка първична култура се субкултивира в съотношение 1: 2, когато MSC достигне приблизително 80% сливане.
За адипогенна и остеогенна диференциация, StemPro® (Invitrogen Co., USA) са използвани адипогенеза и диференцираща среда за остеогенеза съгласно протокола на производителя. Културите се подновяват на всеки 2 до 3 дни. След 3 до 4 седмици култивиране се оценява адипогенезата чрез инкубиране на клетките с разтвор на Oil Red O за оцветяване на неутралните липиди в цитоплазмата. Alizarin Red S (Sigma-Aldrich, САЩ) е използван за оценка на остеогенната диференциация.
За да се потвърди характеристиката на MSC, клетките, отгледани в пасаж 3, се подлагат на поточна цитометрия, като се използват маркираните с FITC маркери CD29, CD31, CD34, CD45, CD90, CD105 и CD166 (BD Biosciences, САЩ), концентрации, препоръчани от производителя. Клетките, оцветени с белязан с FITC IgG, бяха използвани като отрицателни контроли. Анализът използва FACScan за поне 10 000 събития, използвайки софтуера CellQuest.
Анализ на жизнеспособността на клетките
MSC жизнеспособността на клетките се оценява, като се използва анализ на 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTT; Sigma-Aldrich, САЩ). Накратко, MSCs бяха засяти в 96-ямкови плаки. След третиране с различни дози Ex-4 (0-20 nm/L, Sigma-Aldrich) в продължение на 12 h, клетките се инкубират с MTT разтвор (Sigma-Aldrich) при 37 ° C в продължение на 4 h. След това средата се отстранява и към всяка ямка се добавят 100 ul диметилсулфоксид (DMSO). Абсорбцията е измерена при дължина на вълната 570 nm. Данните се изразяват като съотношение между стойността на оптичната плътност (OD) на третираната група и OD на контролната група.
Проточна цитометрия
Експресията на CXCR4, скоростта на апоптоза и разпределението на клетъчния цикъл на MSC бяха оценени чрез поточна цитометрия. След третиране с различни концентрации на Ex-4 (0-20 nm/L) в продължение на 24 часа, MSC се използва при РЗ за откриване на експресията на CXCR4. След измиване с PBS, всяка група клетки се оцветява с FITC-белязан CXCR4 (Bioss, Китай) или с FITC-белязан IgG в продължение на 30 минути при стайна температура.
Броят на апоптотичните клетки се анализира количествено, като се използва анексин V комплект за откриване на апоптоза - FITC/PI (BD Biosciences, САЩ). След третиране, клетките се събират, ресуспендират в 200 ul свързващ буфер и след това се инкубират с 5 ul смес от Анексин V-FITC/свързващ буфер (30 минути, 37 ° С) на тъмно. След това клетките се инкубират с 10 ul пропидиев йодид в продължение на 5 минути и веднага се анализират чрез двувариантна поточна цитометрия, използвайки BD FACSCalibur цитометър.
За анализ на клетъчния цикъл, MSC се третират с Ex-4 (0-20 nm/L) в продължение на 24 часа. След това клетките бяха ресуспендирани в PBS и фиксирани с ледено студен 70% етанол за 24 часа. Фиксираните клетки се изплакват и ресуспендират в 50 ug/ml пропидиев йодид за 30 минути на тъмно. Анализите на поточната цитометрия бяха извършени с помощта на BD FACSCalibur цитометър.
Анализ на клетъчна пролиферация
Клетъчната пролиферация се оценява с анализ на 8 броя клетки (CCK-8) (Институт по биотехнологии Beyotime, Китай) и анализ на пролиферацията на 5-етинил-2'-деоксиуридин (EdU) (RiboBio Co., China). За CCK-8 теста клетките се посяват в 96-ямкови плаки (5 х 10 3 клетки/гнездо) с Ex-4 (0-20 nm/L) в трикратен модел. Тестовете се провеждат 1 до 7 дни след посяването чрез добавяне на 100 ul свежа среда в 10 ul разтвор на CCK-8 за още 2 часа при 37 ° C. OD се измерва при 570 nm. Тестът се повтаря 3 пъти.
Изследването EdU (RIBOBio Co, Гуанджоу, Китай) беше използвано за измерване на способността на клетките да се размножават след третиране с 20 nm Ex-4 в продължение на 24 часа. След инкубация с EdU в продължение на 2 часа, клетките бяха фиксирани с 4% параформалдехид и проникнати с 0,5% Triton X-100. След това, коктейлът Apollo® Reaction (Apollo® 643 Fluorescence and Reaction Buffer) се добавя към средата за още 30 минути на тъмно. След промиване с PBS 3 пъти, клетките се оцветяват с DAPI (Sigma-Aldrich) в продължение на 5 минути и веднага се наблюдават под флуоресцентна микроскопия. Броят на клетките EdU + се изчислява чрез преброяване на поне три произволно разделени полета.
Анализ на западните болтове
Анализи за миграция и заздравяване на рани.
MSC анализът за миграция се извършва с 24-ямкова камера Transwell с размер на порите 8 µm (Corning, USA). Първо, MSC се култивират с Ex-4 (0-20 nm/L) за 24 h; след това в горната камера в среда без серум се посяват 10 5 MSC. Стромен клетъчен фактор 1а (SDF-1, Sigma-Aldrich, 50 ng/ml) се добавя към долната камера. След 12-часова инкубация при 37 ° С, немигриращите клетки в горната камера бяха внимателно отстранени с памучен тампон и клетките, преминали през мембраната, бяха фиксирани в метанол и оцветени с 0 кристално виолетово. 05%. За количествено определяне броят на мигриралите клетки се изчислява чрез преброяване на поне пет отделни случайни полета като съотношение на експерименталните проби към контролните проби x 100.