Ефект на кверцетин върху жизнения цикъл на вирусни мишени на вируса на хепатит с от

Субекти
Обобщение
Въведение
Резултати
Ефект на кверцетин върху жизнения цикъл на HCV в клетки Huh-7.5
Ефект на кверцетин върху жизнения цикъл на HCV в първичните човешки хепатоцити
Когато се прилага директно върху HCV частици, кверцетин намалява тяхната инфекциозност.
DGAT1, възможен кандидат за цел на кверцетин в контекста на HCV инфекция
Ефект на кверцетин върху LD размера и субклетъчната локализация на HCV ядрения протеин
Дискусия
Материали и методи
Реактиви, антитела, плазмиди и грундове.
Клетъчна култура
Кверцетин Анализ на цитотоксичността
Производство на HCV, оценка и анализ на инфекцията.
Вирусологичен анализ
Нива на HCV РНК: репликационни анализи
РНК изолация, обратна транскрипция и количествена полимеразна верижна реакция в реално време (RT-PCR)
Производство на HCV псевдочастици
DGAT тест за активност
Имунофлуоресценция и оцветяване с маслено червено O
Оценка на съвместно местоположение
Статистически анализ
Допълнителна информация
Допълнителна информация
Word документи
Допълнителна информация
Коментари

Субекти

Обобщение

Кверцетинът е естествен флавоноид, за който е доказано, че има свойства срещу вируса на хепатит С (HCV). Точните механизми, чрез които кверцетинът влияе върху жизнения цикъл на HCV, не са напълно изяснени. Оценихме ефекта на кверцетин на различни етапи от жизнения цикъл на HCV в заразени с HCV клетки Huh-7.5 и първични човешки хепатоцити (PHH). И при двата типа клетки кверцетинът значително намалява i) репликация на вирусния геном; ii) производството на инфекциозни HCV частици и iii) специфичната заразност на новопроизведените вирусни частици (съответно 85% и 92%, Huh7,5 и PHH). Освен това, когато се прилага директно върху HCV частици, кверцетинът намалява своята заразност с 65%, което предполага, че влияе върху целостта на вириона. Интересното е, че кверцетинът предотвратява индуцираната от HCV повишена регулация на диацилглицерол ацилтрансферазата (DGAT) и типичното локализиране на HCV ядрения протеин на повърхността на липидните капчици, за което е известно, че се медиира от DGAT. В заключение изглежда, че кверцетинът има преки и медиирани от гостоприемника антивирусни ефекти срещу HCV.

Въведение

Вирусът на хепатит С (HCV) е РНК вирус с положителна верига, принадлежащ към семейство Flaviviridae 1 със 7 основни генотипа 2. Спектърът на заболяването варира от остър до хроничен хепатит, цироза и хепатоцелуларен карцином.

Жизненият цикъл на HCV е тясно свързан с липидния метаболизъм на клетката гостоприемник. Механизмите, свързващи HCV инфекцията и липидния метаболизъм, включват 3, 4: (a) HCV циркулира като обогатени с липиди частици, наречени липовичастици (LVP) 5; (b) LVPs са HCV частиците с най-висока инфекциозност поради тяхната асоциация с липопротеини 6; (в) няколко рецептора, участващи в усвояването на липидите, например, рецепторът за липопротеини с ниска плътност (LDL), Niemann-Pick C1-подобен 1 (NPC1L1) 7 и SR-B1, участват в навлизането на LVP в хепатоцита 8; (d) Сглобяването на HCV се случва в непосредствена близост до липидни капчици (LD) 9, 10; (д) HCV инфекцията насърчава натрупването и преразпределението на LD в перинуклеарната област 11; (f) диацилглицерол ацилтрансфераза-1 (DGAT1), ензим, който синтезира триглицериди (TG) в ендоплазмения ретикулум, взаимодейства с основния протеин на HCV и участва не само в образуването на нова LD, но и в производството на инфекциозен HCV 12; (g) Съобщава се, че HCV изолира пътя на секреция на липопротеини с много ниска плътност (VLDL) за секреция на вирусни частици 13 .

Лечението с директно действащи антивирусни лекарства (DAA) е променило драстично резултатите от хепатит С. В действителност процентите на устойчив вирусен отговор (SVR) са достигнали рекордни нива (> 95%) 14, 15 без съответни нежелани събития. Цената обаче остава една от основните пречки за постигане на премахване на хепатит С, главно в страните с ниски и средни доходи 16 .

Резултати

Ефект на кверцетин върху жизнения цикъл на HCV в клетки Huh-7.5

За да се оцени ефектът на кверцетина върху репликацията на генома на HCV, клетките Huh-7.5 бяха заразени с HCV, продуциран от клетъчна култура (HCVcc) от щама JFH1 и третирани с 50 μM кверцетин, т.е. концентрация при тази, която не се наблюдава токсичен ефект (фиг. S1A, a и b). Кверцетинът значително намалява вътреклетъчното количество на HCV РНК с отрицателна верига, отличителен белег за репликация на HCV геном, оценено на 1 ден след инокулация (61% ± 5,89% инхибиране; p = 0,0084) и на 3 ден след инокулация (68,38% ± 10% инхибиране;

Huh-7.5.1 клетки бяха заразени с JFH1 в продължение на 6 часа и след това третирани с 50 μM кверцетин (JFH1 + Q50 μM) или DMSO като контролен носител, в продължение на 24 часа ( да се ) или 72 часа ( b, d ). ( а, б ) Клетките се лизират, за да се определи количествено HCV РНК с отрицателна верига. ( c, d ) Културни супернатанти бяха събрани за определяне на извънклетъчното ниво на HCV РНК и титъра на инфекциозност. Резултатите се изразяват като процент от контрола върху превозното средство. Данните са представени като средни стойности ± SD, получени от три независими експеримента.

Изображение в пълен размер

Ефект на кверцетин върху жизнения цикъл на HCV в първичните човешки хепатоцити

PHHs бяха заразени с JFH1 (MOI от 2.5) в продължение на 6 часа и след това третирани с 50 μM кверцетин (JFH1 + Q50 μM) или DMSO като контрол на носителя, в продължение на 24 часа ( да се ) или 72 часа ( b, c ). ( да се ) Клетките се лизират, за да се определи количествено HCV РНК с отрицателна верига. ( b, c ) Културните супернатанти бяха събрани за определяне на извънклетъчно ниво на HCV РНК и титър на инфекциозност, съответно. Резултатите се изразяват като процент от контрола на носителя. Данните са представени като средни стойности ± SD, получени от два до три независими експеримента.