Дълговерижните сфинголипидни основи се транспортират до клетките чрез синтетази на

сфинголипидни

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • ACS Faa1 и Faa4 участват в усвояването на LCB
  • Намаляването на абсорбцията на LCB в faa1 клетки Δ faa4 Δ не се причинява от увеличен изход на LCB или променен липиден състав
  • Вносът на LCFA и LCB е конкурентен
  • Абсорбциите на LCFA и LCB се различават по своите енергийни нужди
  • ACSL за бозайници участват в усвояването на LCB
  • Дискусия
  • Методи
  • Щамове на дрожди и среда
  • Клетъчна култура
  • Плазмиди
  • Тест за усвояване на липиди
  • DHS тест за освобождаване
  • [3Н] DHS тест за маркиране
  • Имуноблот
  • Инвитро ACS анализ
  • Допълнителна информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

Субекти

Обобщение

Въведение

Клетките абсорбират различни извънклетъчни вещества през плазмената мембрана и ги използват като източници на енергия или предшественици на биомолекули. Тъй като хидрофобната бариера, образувана от липидни бислои, не позволява транспортирането на хидрофилни материали, клетките трябва да ги внасят чрез специфични транспортери. Все още не се стига до заключение дали хидрофобните материали, като мастни киселини (FA), навлизат в клетките при физиологични условия чрез пасивна дифузия или чрез транспортери.

Досега транспортните дейности на FA на членовете на семейство ACS не са експериментално проверени с помощта на пречистени протеини поради технически трудности, присъщи на такива in vitro анализи, което води до дебати дали ACS функционира само при активиране на FA или и двете при активиране на FA и при транспортирането на FA 5, 8. В първия случай ACS би причинил видимо увеличаване на усвояването на LCFA чрез улавяне на LCFA като ацил-CoA, така че те да не се дифузират в извънклетъчните пространства или чрез намаляване на вътреклетъчната концентрация на LCFA. В последния случай транспортът и активирането на LCFA от ACS ще бъдат свързани, процес, наречен вектор ацилация.

Сфинголипидите са един от основните липидни компоненти на еукариотните мембрани и имат широк спектър от физиологични функции, включително клетъчна адхезия, образуване на бариера за пропускливост на кожата, поддържане на миелин, имунитет, сперматогенеза и метаболизъм на глюкозата 9, 10, 11, 12, 13, 14 15. Церамидът, хидрофобният скелет на сфинголипидите, е изграден от FA и дълговерижна основа (LCB). Най-разпространената LCB при бозайниците е сфингозинът (SPH), който съдържа транс двойна връзка между позиции C4 и C5 (фиг. 1а). SPH и наситеният дихидросфингозин LCB (DHS) съществуват навсякъде сред тъканите на бозайници. Дрождите нямат SPH, но съдържат DHS и фитосфингозин (PHS), който има хидроксилна група в позицията C4 16 (фиг. 1а). При бозайниците PHS съществува в специфични тъкани, като кожата, тънките черва и бъбреците 9 .

Изображение в пълен размер

Не всички липиди могат да бъдат транспортирани в клетки: по-скоро само няколко класа липиди, включително LCFA, LCB и моноацилглицероли, могат да го направят ефективно. Ефективността на абсорбция на други класове липиди, като сложни сфинголипиди, керамиди, S1P, триацилглицерол и глицерофосфолипиди, е ниска. Въпреки че естествените керамиди и глицерофосфолипиди с LCFA почти не се внасят в клетките такива, каквито са, скъсяването на FA частта им позволява (т.е. изкуствени късоверижни керамиди и глицерофосфолипиди) да влязат. Освен това ефективността на транспортиране на наситени LCFAs, като палмитинова киселина и стеаринова киселина, е висока, докато тези на наситените VLCFAs, като арахидова киселина и бехенова киселина, са ниски. Следователно можем да заключим, че липидите, които могат ефективно да влязат в клетките, споделят обща структура: дълговерижен хидрофобен гръбнак и малка група от полярни глави.

Предполагаме, че структурният фактор, ограничаващ транспорта на определени липиди до клетките, е специфичността на субстрата на един или повече често срещани транспортери. Поради това изследвахме участието на ACS в усвояването на LCB, използвайки генетично проследими дрожди. Установихме, че поглъщането на LCB е значително намалено при мутант с двойно делеция на ACS (faa1Δfaa4Δ). Освен това превозите LCFA и LCB бяха взаимно конкурентни. Тези резултати предполагат, че Faa1 и Faa4 действат като транспортиращи както за LCFA, така и за LCB. Трудността при разграничаването на транспорта на LCFA от метаболитната активност (добавяне на CoA) създаде дългогодишния дебат за ролята на ACS в усвояването на LCFA, както е описано по-горе. Този дебат обаче не се отнася за LCB: те не притежават карбоксилна група, акцептор на CoA, така че катализираният от ACS етап на активиране не може да се осъществи в LCB. Нашите резултати ясно разграничават транспортните и ACS дейности за LCB и показват, че ACS имат транспортна функция. Освен това открихме, че членовете на семейство ACSL, хомолозите на бозайниците на ACS Faa1 и Faa4, участват в транспорта на LCB при бозайници.

Резултати

ACS Faa1 и Faa4 участват в усвояването на LCB

Първо изследвахме времевия ход на усвояването на [3 H] DHS и го сравнихме с този на [3 H] палмитинова киселина. Вносът на DHS беше бърз и започна да се стабилизира около 5 минути (фиг. 1б). Транспортът на палмитинова киселина е по-бавен от DHS и се увеличава линейно до 30 минути (фиг. 1в). Имайки предвид тези резултати, ние определяме 5 минути и 30 минути като съответните инкубационни периоди за тестовете за усвояване на [3 H] DHS и [3 H] палмитинова киселина в следващите анализи. След това изследваме скоростта на усвояване на [3 H] DHS при различни концентрации. Скоростта на поглъщане се увеличава почти линейно до 40 μM (фиг. 1г).

25% от тези от клетки от див тип, количество, което корелира добре с това, получено от анализа на усвояването на липидите (фиг. 1д). По този начин транспортът на DHS е намален във faa1Δfaa4Δ клетки и е проверена полезността на анализа за усвояване на липидите.

След това изследвахме участието на Faa1 и Faa4 в транспорта на две други LCB, PHS и SPH, до клетки. DHS и PHS са естествени LCB в дрождите. От друга страна, SPH, който е основният LCB при бозайниците, не съществува в дрождите, но може да бъде внесен и метаболизиран, ако е добавен екзогенно 26, 28, 29. Установихме, че не само поглъщането на DHS, но също така SPH и PHS са намалени в faa1Δfaa4Δ клетки (фиг. 1g). Тези резултати показват, че Faa1 и Faa4 участват в усвояването на всички видове LCB, изследвани.

Ако Faa1 и Faa4 функционират в приемането на LCB като липидни транспортери, те трябва да бъдат локализирани в плазмената мембрана. За да проверим тази хипотеза, ние изследвахме местоположението на Faa1 и Faa4 хромозомно слети с GFP чрез микроскопско наблюдение. Установихме, че Faa1-GFP се намира главно в плазмената мембрана (фиг. 1h). Faa4-GFP също е локализиран в плазмената мембрана, но само частично; по-голямата част е била разположена във вътрешни органели. Частичната локализация на Faa4 в плазмената мембрана е в съответствие със слабата транспортна активност на Faa4 (фиг. 1д).