Чернодробно насочен ген трансфер в човешка хепатобластома клетъчна линия и in vivo

Обобщение

Достъпът е предоставен от

Главен

Основните ограничения на вирусните вектори, особено тези, свързани с безопасността и имуногенността, доведоха до проучвания за подобряване на невирусните методи за доставка на гени. 1 Сред такива невирусни вектори, катионните липозоми са една от най-обещаващите невирусни системи за използване в генната терапия. 2 Ефективното доставяне на функционални терапевтични гени в целевите клетки е основен проблем в подходите за генна терапия за лечение на рак и метаболитни заболявания, както и инфекция с вируса на човешка имунна недостатъчност.

Предполагаме, че електростатичното взаимодействие на катионни SG липозоми с ДНК не е било достатъчно, за да позволи образуването на липозомен/ДНК комплекс с малък размер на частиците. Следователно, ние проектирахме силно положително заредени липозоми с малък размер, които след смесване с водна фаза, съдържаща ДНК, могат да бъдат заредени с ДНК, което води до образуването на малък комплекс липозома/ДНК. За селекция на черния дроб ние приготвяме липозоми, съдържащи β-ситостерол β-D-глюкозид (Sit-G), който е основният компонент на SG (Sit-G липозоми). За да увеличим положителния заряд в липозомите, избрахме реагент Tfx-20 (Tfx) и 3β [N - (N ', N' -диметиламиноетан) -карбамоил] холестерол (DC-Chol) като катионни липиди, тъй като първият е синтетично катионно липидно съединение [[N, N, N ', N' -тетраметил-N, N '-бис (2-хидроксиетил) -2,3-ди (олеоилокси) -1,4-бутандиамониев йодид], провеждащо при високи нива Ефективността на трансфекцията в клетъчните линии 13 и последната вече се използва клинично за генна терапия. 14, 15 За да приготвим малки липозоми, използваме модифицирания метод за инжектиране на етанол.

В това проучване ние подготвяме малки високо положително заредени Sit-G липозоми, оптимизираме съотношението на плазмидната ДНК, кодираща луциферазния репортерен ген към Sit-G липозомите, като оценяваме ефективността на трансфекцията в HepG2 клетки в присъствието на серум в средата и изследва генната експресия на Sit-G DNA/липозомния комплекс след интравенозно инжектиране при мишки.

Показано е, че липозомите Sit-G (78 ± 2 nm) с висок потенциал от .8 положителни (33.8 ± 7.0 mV) имат кръгла форма чрез микроскопско наблюдение (данните не са показани). Липозомната суспензия Sit-G е много стабилна и може да се съхранява няколко месеца при 4 ° C без промяна в размера на частиците (данните не са показани). Размерът на частиците и потенциалът на липозомните/ДНК комплекси Sit-G зависят от съотношението на зареждане (+/-) на катионния липид към ДНК (Фигура 1). При съотношение на заряд (+/-) от приблизително 3, се наблюдава най-големият среден размер на частиците и дисперсия на комплекса (1200 ± 247 nm), когато потенциалният подход се приближава приблизително до нула (0,1 ± 0,3 mV). С изключение на съотношението на зареждане от 3, размерът на частиците на липозомния/ДНК комплекс е в диапазона от приблизително 100-250 nm.

човешка

Изображение в пълен размер

За да се оптимизира съотношението на ДНК към Sit-G липозоми, експресията на репортерния ген беше изследвана в HepG2 клетки, трансфектирани със Sit-G липозоми при различни съотношения на натоварване (+/-) в среда със или без серум (Фигура 2). Съотношението на натоварване (+/−), свързано с по-високата ефективност на трансфекция на липозома/ДНК комплекс Sit-G, беше променено от 3 на 4 чрез добавяне на 10% серум към средата. При инкубация в продължение на 1 h в среда, съдържаща серум, размерът на частиците на липозомния/Sit-G ДНК комплекс при съотношение на натоварване (+/−) 4 се увеличава от 240 ± 16 nm до приблизително 3 μm, а потенциалът de намалява от 27,9 ± 5,1 mV до -8,9 ± 2,1 mV. Различни компоненти на серума, като говежди серумен албумин (BSA), хепарин, имуноглобулин G и липопротеини променят потенциала на липозомния/ДНК комплекс от положителен към отрицателен или неутрален. 16, 17 Следователно, липозомният/ДНК комплекс в серум-съдържаща среда може да изисква излишен положителен заряд, което води до увеличаване на съотношението на зареждане (+/-) за висока ефективност на трансфекция от 3 до 4.