Атомни основи за терапевтично активиране на калиеви невронални канали.

терапевтично

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Ретигабинова модулация на KCNQ канали чрез Trp S5
  • Неестествена аминокиселинна мутагенеза на канали KCNQ3
  • Загуба на ретигабинови ефекти след отстраняване на Trp265 H връзка
  • Фина настройка на силата на взаимодействието Trp265-ретигабин
  • Относителен принос на предполагаемите остатъци, свързващи лекарства.
  • Идентифициране на вероятен Н-свързващ донор в ретигабин
  • Дискусия
  • Методи
  • Молекулярна биология и in vivo потискане на глупости
  • Записи на двуелектродна скоба за напрежение
  • Молекулярни симулации на свързване на ретигабин
  • Анализ на данни
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

Субекти

  • Йонни канали
  • Мембранни протеини
  • Молекулярна биофизика

Обобщение

Въведение

Епилепсията е често срещано, хетерогенно и често инвалидизиращо разстройство, което засяга приблизително 1% от населението на света. Настоящото клинично лечение на пациенти, страдащи от епилепсия, се извършва главно чрез медикаменти, въпреки че е общоприето, че ∼ 30% от новодиагностицираните пациенти с епилепсия ще бъдат резистентни към често срещаните антиконвулсанти 1, 2. Освен това споменатото съпротивление е свързано с вида на атаката; например, съобщено е, че 60% от пациентите с фокална епилепсия ще развият и поддържат лекарствена резистентност 3. Тези недостатъци са мотивирали търсенето на нови антиепилептични лекарства, неконвенционални лечения за епилепсия (като кетогенната диета) и непрекъснатото идентифициране и валидиране на нови фармакологични цели 4, 5, 6, 7 .

Използвали сме неестествена аминокиселинна мутагенеза, за да пренаредим атомите и електроните от страничната верига Trp на мястото на свързване на ретигабина. Нашите открития показват, че повторното позициониране на индолния азотен атом на KCNQ3 Trp265 напълно елиминира ефектите на ретигабина, което предполага, че взаимодействието на ретигабина изисква образуването на Н връзка с Trp265. Важността на това взаимодействие с H-връзка се илюстрира допълнително чрез въвеждането на флуорирани Trp аналози (с по-висока склонност към H-връзки) в KCNQ3 Trp265, което води до повишена сила на лекарството. Използвайки множество аналози на ретигабин, ние идентифицирахме електростатичен пръстов отпечатък около акцептор на Н-връзка, който корелира с ефикасността на лекарството. Тези експериментални ограничения идентифицират специфични атоми и химични сили, участващи в ретигабиновите взаимодействия, и подчертават подходи, които могат да бъдат използвани за насочване на рационалното подобряване на съществуващите лекарства.

Резултати

Ретигабинова модулация на KCNQ канали чрез Trp S5

( да се, б ) Проводимост-напрежение за ( да се ) KCNQ2 (n = 3) и KCNQ2 [Trp236Phe] (n = 6), и ( б ) KCNQ3 * (n = 5) и KCNQ3 * [Trp265Phe] (n = 3) хомомерни канали заедно с посочените мутанти (концентрация на ретигабин от 100 цМ). ( ° С ) Проводимост-напрежение за хетеромерни комбинации от KCNQ2 и KCNQ3 (съотношение 1: 1 на инжектирана иРНК, със или без Trp → Phe мутации, както е посочено, n = 5 за всяка комбинация), използвани за генериране на канали с намален брой на свързване на ретигабин сайтове. ( д ) Обобщение на V 1/2 промени в 100 μM насищане на ретигабин за мутации KCNQ2 Trp236 и KCNQ3 Trp265, както е посочено (* P 19, 20 .

Тествахме дали позицията KCNQ3 Trp 265 играе роля при регулирането на реакциите на канала към PIP 2. Използвайки чувствителната към напрежение фосфатаза ciona intestinalis, чувствителна към напрежение фосфатаза (CiVSP), за да хидролизираме PIP 2 до деполяризирани напрежения, пулсирахме ооцити чрез набор от предварителни импулсни напрежения, последвани от -20 mV тестов импулс за оценка на активността на канала след изчерпване на PIP 2 27 . Наблюдавахме подобно намаляване на канала с стъпки на деполяризационно напрежение в каналите KCNQ3 * и KCNQ3 * [Trp265Phe], което показва, че Trp265 не оказва значително влияние върху ефектите на анионните фосфолипиди върху функцията на канала (Фиг. 1д, f). Като цяло тези открития илюстрират, че остатъкът KCNQ3 Trp265 е от съществено значение за ефектите на ретигабина, но не играе съществена роля в регулирането на активирането на канала чрез напрежение или PIP 2. .

Неестествена аминокиселинна мутагенеза на канали KCNQ3

За да изследваме основния механизъм на взаимодействията на ретигабина с тази съществена странична верига на Trp, използвахме неестествена аминокиселинна мутагенеза, за да въведем леко променени варианти на Trp (Фиг. 2а). С този метод стоп кодон (TAG) се поставя в гена на йонния канал на място, което представлява интерес, и тази иРНК се инжектира съвместно в ооцитите на Xenopus laevis заедно със синтетична аминокиселинна ацилирана tRNA (носеща не-аминокиселина естествен), който е ортогонален на синтетичните ксенопус тРНК 28 пътища. Когато машината за транслация на рибозома срещне въведения TAG стоп кодон, комплементарната синтетична тРНК (с антикодон CUA) позволява добавената аминокиселина да бъде отчетена и включена в йонни канали с пълна дължина (фиг. 2а) 29 .

Загуба на ретигабинови ефекти след отстраняване на Trp265 H връзката

Относителен принос на предполагаемите остатъци, свързващи лекарства.

( да се ) Съотношенията проводимост-напрежение бяха събрани за посочените мутантни канали KCNQ3 * (n = 4-6 на мутант), в 0, 100 или 300 цМ ретигабин. ( б ) ΔV 1/2 максимум в 300 μM ретигабин, измерен във всеки мутант канал. Лентите за грешки в да се, б представляват sem ( ° С ) Ретигабинът е свързан с молекулярен модел на порообразуващия домен на KCNQ3 (вж. Справка 19). Показани са две ориентации с карбаматната група в близост до Leu314 („оригинален“ модел) или Trp265 („флип“ модел). Двата модела на свързване се припокриват в „наслагването“, показвайки сходното пространство, заето от двете лекарствени ориентации.