Триизмерна мозъчна цитоархитектура на мозъка, разкрита чрез фазова контрастна томография
- Субекти
- Обобщение
- Въведение
- Резултати
- Дискусия
- Методи
- приготвяне на пробата
- Лабораторна настройка
- Обработка на данни (лабораторна настройка)
- Конфигурация ID19 (ESRF)
- Обработка на данни (ID19)
- Допълнителна информация
- PDF файлове
- Допълнителна информация
- Видеоклипове
- Допълнително видео 1
- Допълнително видео 2
- Коментари
Субекти
Обобщение
Въведение
Тук представяме фазова контрастна томография, базирана на размножаване, в оптимизирана комбинация от лабораторен източник на струя течен метал 20, инструментариум, подготовка на проби и алгоритъм за реконструкция, за да изобрази големи обеми мозъчна тъкан на мишка. Можем да покажем, че в рамките на реконструирания обем може да се постигне висок контраст без етикетиране и че в рамките на област от интерес (ROI) могат да се визуализират отделни неврони. Това дава достъп до непокътнатата 3D цитоархитектура на мозъка.
В нашата нова техника за подготовка на проби ние поставяме тъканта в ксилол след дехидратация в етанол, подобно на конвенционалните протоколи за вграждане в парафин. Като решаваща и нова стъпка пропускаме всякакви допълнителни процедури за включване или контрастиране и измерваме пробата след изпаряване на органичния разтворител. За разлика от оцветяването с елементи с високо съдържание на Z, тази техника, която наричаме EOS подготовка (изпаряване на органичен разтворител), значително намалява абсорбцията поради отстраняването на вода и липиди, като същевременно генерира нов контраст между протеиновата матрица. Околната тъкан и въздуха.
Реконструкцията започва с фазово възстановяване на прожекционните изображения, записани за всеки ъгъл θ на томографско сканиране. За обекти с бавно променяща се абсорбция при малки разстояния на разпространение z зад обекта, разпределението на интензитета може да бъде изразено чрез приблизителна форма на уравнението за пренос на интензитета 21
където I 0, θ ( r ⊥) и ϕ θ ( r ⊥) обозначават интензивността и фазовото разпределение непосредствено зад обекта и
където беше заменен от α γ-зависимия параметър на регуларизация. Установихме, че този подход за реконструкция, предложен от Witte et al. и известна като корекция с помощта на Бронников (BAC) 22, тя предлага превъзходни резултати за текущите неоцветени тъкани и използваната микрофокусна CT конфигурация 23. Следователно, той се използва като алгоритъм по подразбиране в настоящата работа (фиг. 1г, д). След прилагане на алгоритъма за възстановяване на фаза във всяка проекция на томографското сканиране, 3D реконструкцията се извършва с филтрирана задна проекция (конусен лъч) 24. Имайте предвид, че контрастът на реконструирания обект трябва да се разглежда като ефективно количество, първо, тъй като както абсорбцията, така и фазовото взаимодействие допринасят за неговите стойности, и второ, тъй като поради съображения за потока КТ на лабораторията обикновено използва широколентова радиация за разлика от синхротронната КТ.
Изображение в пълен размер
Ние демонстрираме възможностите на лабораторната обстановка, като изобразяваме различни региони от интерес в мозъка на мишки от див тип.
Резултати
Комбинация от режими на изобразяване на конусен лъч и обратна геометрия (да се) Представяне на обема на дясното полукълбо на мозъка на мишка, записано в геометрия на конусен лъч. Сивите равнини показват позицията на разрезите, показани в ( б, ° С ). (б, в) Коронален/хоризонтален разрез през реконструирания обем. (д) Реконструиран коронарен разрез на хипокампалната област с клетъчна резолюция, записан в обратна геометрия. Позицията на измерването с висока разделителна способност спрямо общия обем на пробата е посочена в ( б ). Преди томографска реконструкция индивидуалните изгледи бяха преизбрани с коефициент 2. (и) Проекция с максимален интензитет от 31 последователни среза, имитиращи хистологичен разрез с дебелина 30 μm. (F) Реконструиран хоризонтален разрез на кортикалната област. (ж) Прожекция с максимален интензитет от 31 среза. Видими кортикални характеристики като полето на цевта са ясно видими. Мащабни ленти: ( б, ° С ) 500 μm, ( d - g ) 200 μm.
Изображение в пълен размер
Обем, спускащ се до клетъчното ниво на мишка на малкия мозък (да се) Напречно сечение през реконструирания обем, показващо молекулярния слой (ML), гранулирания слой (GL), бялото вещество (WM) и клетъчния слой на Purkinje (PCL) на малкия мозък в разрешаване на клетките. Преди томографска реконструкция индивидуалните изгледи бяха преизбрани с коефициент 2. б) Надлъжен разрез през обема показва достатъчно контраст, за да се идентифицират снопчетата от аксони в бялото вещество. (° С) Автоматично представяне на обема на пробата с парче в обема, показващо позицията на клетъчната сегментация, показана в ( д ). (д) Клетъчно сегментиране на малка част от пробата. Скала: 200 μm.