Β-субединицата на глюкозидаза ii, нов субстрат за каспаза-3-подобна активност в

Субекти

Обобщение

Въведение

Резултати

Gas2/HSP90/HSP40 образува свързан с каспаза-3 протеинов комплекс в оризови суспензионни клетки при топлинен стрес

( да се ) Активните фракции на каспаза-3 от колона G-75 се събират и пречистват допълнително на Mono-Q колона, уравновесена с 20 mM Tris/HCl буфер, рН 8.0. Протеините се елуират с NaCl градиент (0

1 М) в 20 mM Tris/HCl буфер, рН 8.0, при скорост на потока от 1 ml/min. Протеините се откриват чрез абсорбция при 280 nm. Събирани са съответно върхове. ( б ) Равен брой пикове, събрани от колоната Mono-Q, бяха инкубирани с Ac-DEVD-AMC. AMC флуоресценцията беше измерена с четец на микроплаки при 30 ° С. RFU/hr представлява относителните разлики във флуоресцентната единица, получени за 1 час. I и II представляват върховете, които проявяват активност, подобна на каспаза-3.

Изображение в пълен размер

Таблица в пълен размер

Профил на експресия на газ2 при различни напрежения.

При физиологични условия Gas2 е некаталитична субединица на глюкозидаза II, която участва в гликозилирането на протеини в ER. За да се идентифицират биологичните функции на Gas2 при абиотичен стрес, експресията на Gas2 се измерва чрез количествена полимеразна верижна реакция в реално време при различни условия, включително при DTT-индуциран ER стрес. Третирането с 6,4 mM DTT индуцира експресията на Os bZIP50 34, маркерният ген за UPR, което показва, че DTT е способен да индуцира ER стрес в клетки в оризова суспензия (фиг. 2а) и при тези условия Gas2 е регулиран надолу ( Фиг. 2б). В допълнение към ER стрес, Gas2 също се регулира надолу при различни абиотични стресове, като студен стрес (фиг. 2в), осмотичен (фиг. 2г) и сол (фиг. 2д).

( да се ) DTT индуцира експресията на OsbZIP50 в клетъчни линии от див тип и OsGas2 RNAi. Протопластите се приготвят от суспензионни клетки и се третират с 6,4 mM DTT в продължение на 18 часа при 26-28 ° С ( б ) Експресия на OsGAS2 в суспензионни клетъчни протопласти с 6.4 mM DTT обработка за различно време. ( в - д ) Експресия на OsGAS2 в корени на 8-дневни разсад с третиране на 4 ° C ( ° С ), 150 mM NaCl ( д ) и 40% от PEG 6000 ( и ) за различно време. Общата РНК беше изолирана за RT-PCR и експериментите бяха повторени три пъти.

Изображение в пълен размер

Клетъчно местоположение

Тъй като Gas2 образува свързан с каспаза-3 протеинов комплекс с GRP94 и HSP40, съдържащ TPR, беше изследвана субклетъчната локализация на тези три протеина. Както се очакваше, Gas2 и GRP94 бяха разположени в ER (фиг. 3а, b), докато HSP40, съдържащ TPR, беше разположен в цитоплазмата (фиг. 3в). Тъй като активността, подобна на каспаза-3, присъства в цитоплазмата, това предполага, че при специфични условия на стрес, съдържащият TPR HSP40 може да образува комплекс с Gas2 и GRP94 на интерфейса ER-цитоплазма, тъй като е известно, че ER осигурява свързващи места за много цитозолни протеини.

Конструкции, носещи 35S: Grp94-GFP, 35S: GAS2-GFP и 35S: GFA2-GFP, бяха съответно въведени в протопласти от стъблата на оризови разсад чрез трансформация, медиирана от PEG-калций. GFP флуоресценция се наблюдава след 16 часа инкубация с конфокален микроскоп PerkinElmer UltraVIEW VoX. Като контрол за локализация на ER се използва ER-Tracker ™ синьо-бял DPX (E12353). Експериментите се повтарят поне пет пъти. Лента = 5 μm.

Изображение в пълен размер

Намаляване на индуцираната от Gas2 автофагия в клетки от суспензия на ориз

Изображение в пълен размер

Gas2 е нов субстрат за каспаза-3-подобна активност в ориза.

( да се ) Неговият таг 6 се слива в N-края на OsGAS2 и мутант D110A/D113A и слетият протеин се експресира в Е. coli. Пречистените диви видове и неговите 6-маркирани мутантни протеини бяха инкубирани съответно с реакционен буфер, каспаза-3 и цитозолна фракция на термично обработени оризови суспензионни клетки. След инкубация, реакционните продукти се анализират чрез 12,5% SDS-PAGE, последвано от имуноблотинг с анти-поли хистидиново антитяло, което разпознава неговия 6-маркиран OsGAS2 N-краен епитоп. Стрелките показват целевите протеинови ленти. ( б ) Схема за фрагментиране на OsGas2 от каспаза-3. OSGas2 с пълна дължина с MW от 74 KDa е илюстриран като линейна молекула с предполагаемо място на разцепване на каспаза-3 DEYD 113, което е обозначено със стрелка. При разграждането на каспаза-3 се получава N-краен фрагмент с MW от 14 KDa (N) и C-краен фрагмент с MW от 60 KDa ( ° С ).

Изображение в пълен размер

Продукт на разцепване на газ-усилена каспаза-3-подобна активност в оризови протопласти

За да се идентифицира възможната функция на продуктите на разпадане на Gas2, фрагменти на Gas2 N и C се експресират в протопласти от оризов мезофил, като се използва индуциран от Dex векторен условен израз и Dex ефективно индуцира експресия на фрагменти (фиг. 6а). В сравнение с експресията на фрагмент N и контрола на вектора, експресията на фрагмент C води до значително увеличение на активността, подобна на каспаза-3 след термична обработка (Фиг. 6Ь). Интересното е, че автофагозомите не са открити в протопласти, експресиращи двата фрагмента след лечение с DTT (данните не са показани).

( да се ) RT-PCR анализ на експресиите на N-крайния фрагмент (N) и С-крайния фрагмент (C) в мезофилни протопласти. Общата РНК се приготвя от протопласти със или без третиране с Dex (контрол) в продължение на 18 часа. 17S РНК се използва като контрола на натоварването. ( б ) Каспаза-3-подобна активност в мезофилни протопласти под експресията на N-крайния фрагмент (N) и С-крайния фрагмент (C). Експресията на N и C се индуцира от Dex в продължение на 18 часа и след това протопластите се третират при 48 ° С в продължение на 15 минути и се оставят да се възстановят при 28 ° С в продължение на 6 часа. Като контрола беше използван протопластът с празния векторен условен израз. Равно количество цитозолни фракции бяха инкубирани с Ac-DEVD-AMC и флуоресценцията на AMC беше измерена за 60 минути с микропроцесор при 30 ° C. RFU/mg: относителни флуоресцентни единици на mg протеин.

Изображение в пълен размер

Дискусия

⊥: път на инхибиране, който е демонстриран в този документ; плътна стрелка: път за активиране, преместване или деградация, който е демонстриран в този документ; стрелка на дъската: пътят, който не е проучен в този документ; кръгов кръг: предполагаемият каспаза-3-подобен ензим. Вижте текста за подробности.