Секвенирането на екзома, последвано от генотипиране, предполага sypl2 като ген за чувствителност към

екзома

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Предмети и методи
  • Избор на проби
  • ДНК подготовка и групиране
  • Екзоме секвениране
  • Прочетете последователност на картографиране, извикване на вариант и функционална анотация
  • Вариантна филтрация и обогатяване при затлъстяване.
  • Валидиране на варианти чрез генотипиране
  • Статистически анализ на асоциацията.
  • Резултати
  • Откриване на редки варианти чрез секвениране на екзоми
  • SNV валидиране и анализ на асоцииране
  • Дискусия
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна информация

Субекти

Обобщение

Въведение

Наскоро разработената технология за секвениране с висока производителност допълва SNP масивите и показва способността да открива редки болестотворни варианти чрез дълбоко секвениране на всички известни екзони. 7, 8, 9 Тази технологична революция обещава да изясни сложните заболявания, като позволи нискочестотно, широко геномно търсене на редки и предполагаемо функционални варианти. Екзоме секвенирането може да бъде по-ефективно, когато се прилага при пациенти с по-екстремни форми на често срещани заболявания, като болестно затлъстяване; първо, това увеличава шансовете за получаване на значителна асоциация за редки варианти с висока пенетрантност; второ, генетичните варианти в кодиращата протеинова последователност може да имат по-голяма вероятност да имат силно въздействие върху фенотипа, отколкото вариантите в междугенните региони.

В това проучване ние използвахме секвениране на екзома, за да открием обогатени нискочестотни и редки генни варианти при пациенти със затлъстяване при възрастни и ги утвърдихме срещу по-възрастни възрастни със затлъстяване. Ние разсъждавахме, че по този начин ще обогатим гените за затлъстяване сред случаите и ще ги филтрираме в контролите. Тук докладваме вариант, свързан с нискочестотно затлъстяване в кодиращата област на гена на синаптофизин тип 2 (SYPL2).

Предмети и методи

Избор на проби

Таблица в пълен размер

Не-затлъстелите контроли за секвениране на екзоми са имали сколиоза. В противен случай всички други контролни субекти са здрави според самоотчета. Имаше свръхпредставителство на жени в изследваните кохорти. Затлъстелите жени са по-склонни да търсят медицинска помощ за затлъстяването си. Сколиозата е по-често срещана сред жените. Темите бяха от европейски произход и живееха в Швеция. Изследването е одобрено от местните комисии по етика и всички субекти са дали своето информирано съгласие за участие.

ДНК подготовка и групиране

Геномната ДНК се получава от PBMC, като се използва QiAmp DNA Blood Maxi Kit (Cat. No. 51194, Qiagen, Hilden, Германия). Чистотата и качеството на ДНК се потвърждава от съотношението A260/280> 1,8 в Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) и електрофореза в агарозен гел. Концентрацията на ДНК беше измерена от Qubit (Life Technologies, Стокхолм, Швеция). Впоследствие взехме 0,8 μg от всяка ДНК проба и ги разпределихме на случаен принцип в 10 групи, всяка от които съдържа 10 проби от случаи със затлъстяване или контролни групи. Събраните концентрации на ДНК проби бяха измерени с Qubit и пробите бяха пуснати на агарозен гел.

Екзоме секвениране

Секвенирането на екзома се извършва в лабораторията Science for Life (SciLifeLab), Стокхолм, Швеция. Всяка ДНК библиотека се приготвя от 3 µg обединена геномна ДНК. ДНК беше изрязана при 300 bp с инструмент Covaris S2 и обогатена с комплект SureSelectXT Human All Exon 50 Mb и работна станция Agilent NGS в съответствие с инструкциите на производителя (SureSelectXT автоматизирано обогатяване на целите за двойно мултиплексирано секвениране на Illumina, версия A, Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ).

Обединяването беше извършено на система за изграждане на клъстер cBot, използвайки сдвоен комплект за четене на клъстер за четене HiSeq в съответствие с инструкциите на производителя (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Пробите бяха секвенирани на Illumina HiSeq 2000 като сдвоени четения при 100 bp/четене (Illumina). Всички ленти бяха обогатени с 1% phiX контролна библиотека, с изключение на лента 8, която беше 2% phiX. Провеждането на последователността се извършва в съответствие с инструкциите на производителя. Основното преобразуване е направено с помощта на Illumina OLB v1.9 (Illumina).

Прочетете последователност на картографиране, извикване на вариант и функционална анотация

Четенията на последователността бяха подравнени към текущата човешка референтна последователност (монтаж hg19, NCBI компилация 37) (//hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/) с помощта на Burrows-Wheeler Aligner (BWA версия 0.6.1,//bio-bwa.sourceforge.net/, Li и Durbin 12) с параметър за отчитане на изрязване - q от 20. Вариантите на последователността бяха извикани от функцията за многократно натрупване на samtools-0.1.18 (//samtools.sourceforge. net /), с минимално качество на картографиране 20 и минимална дълбочина на четене 5 × за филтриране. PCR дубликатите бяха премахнати с помощта на samtools преди така наречения вариант. За функционално анотиране на варианти на последователности използвахме annovar (//www.openbioinformatics.org/annovar/, Wang et al 13), за да интегрираме информация от различни бази данни в публични домейни, като например генната справка (/ /hgdownload.soe . ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/refGene.txt, 2013), dbSNP (SNP135, //hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp137.txt.gz) и проекта 1000 Genome (//www.1000genomes.org/).

Вариантна филтрация и обогатяване при затлъстяване.