РАЗДЕЛЯНЕ И БИОХИМИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА НА ЕНЗИМНИЯ 1,3-ПРОПАНОДИОЛ ОКСИДОР РЕДУКТАЗА ОТ
РАЗДЕЛЕНИЕ и биохимични характеризиране на ензима 1,3 PROPANODIOL OXIDORREDUCTASE идващи от РОДЕН щам на Clostridium SPP IBUN 158 NIXYOLLY АЛЕКСАНДРА CUCAITA Васкес Industrial Микробиолог PUJ код 186286 микробиология университетски институт следдипломна теза за оптимизиране на UNACULTÍA MICROBIROBIOLOGÍA UNIVERSOGRADO УНИВЕРСИТЕТ MICROBIA завършил тезата за UNACULTURAL ИНСТИТУТ ПО БИОЛОГИЯ. ОТ КОЛУМБИЯ БОГОТА DC, КОЛУМБИЯ 2010
РАЗДЕЛЯНЕ И БИОХИМИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА НА ЕНЗИМА НА 1,3-ПРОПАНОДИОЛ ОКСИДОРРЕДУКТАЗА ОТ НАТИВЕН ШТАМ Clostridium spp IBUN 158 NIXYOLLY ALEXANDRA CUCAITA VÁSQUEZ Индустриален микробиолог P.U.J. Код 186286 Директор ДОЛИ. Доцент по линия на групата за биопроцеси и биопроспекция „Солвентогенни микроорганизми“ ПОДДИСКУЛАТИВНИ ИНТЕРФАЛЦИИ НА МИКРОБИОЛОГИЧЕН ИНСТИТУТ ПО БИОТЕХНОЛОГИЯ НАЦИОНАЛЕН УНИВЕРСИТЕТ В КОЛУМБИЯ БОГОТА, ЦИКЛ 2010
На теб, мама, цялата ми благодарност и вечна любов, че ме подкрепяш и винаги си с мен. На дъщеря ми за нейното търпение и любов, на сестра ми, че ми беше безусловен приятел, на Диего и на цялото ми семейство, че беше подкрепата на тази мечта, която днес е реалност.
ПРИЗНАВАНИЯ Д-р Доли Монтоя Кастаньо за ръководството на тази работа, за това, че ми даде възможност да работя с нея и с изследователска група, която допринесе повече от знанията за живота ми. На моите колеги от групата: Джулиет Серано, Ксимена Перес, Наталия Комба, Маурисио Бернал, Херлинда Амарис, Мария Ангелика Пеня, Йени Росио Мартинес, Карлос Бараган, Гернот Грус, Андрес Гутиерес и всички, които по някакъв начин са част от лабораторията по микробиология. На следдипломната интерфакултура по микробиология, особено на Socorro Prieto за нейната подкрепа и сътрудничество. На Джон Флорес, че ми беше като ангел, за сътрудничеството и търпението, благодаря ви много. На Ана Лусия Кастибланко и Хорхе Кортазар за тяхната готовност и помощ. На моите приятели от магистърска степен, особено Вивиан, Мери, Каролина, Оскитар и Алексис, за това, че са толкова добри приятели, че ме подкрепят и винаги са били там, за да ми дадат добър съвет. На Националния университет в Колумбия за възможността за завършване и завършване на това изследване.
СЪДЪРЖАНИЕ РЕЗЮМЕ 1. ВЪВЕДЕНИЕ 1 2. ТЕОРЕТИЧНА РАМКА 3 2.1. Производство на биодизел 3 2.2. 1,3-пропандиол 4 2.3. Синтез на 1,3-пропандиол 5 2.4. Микроорганизми от рода Clostridium sp. 7 2.5. Физиология на образуването на 1,3-пропандиол в Clostridium sp. 7 2.6. Дехидрогеназни ензими 9 2.6.1. Експериментално измерване на ензимната активност 11 2.6.2. Детекция на място на ензимната активност на 1,3-пропандиол дехидрогеназа 11 2.6.3. Получаване на ензими 12 2.6.4. Пречистване на ензими 13 2.6.5. Определяне на общата концентрация на протеин 14 2.6.6. Ензимна характеристика 14 2.7. Напредък на групата за биопроцеси и биопроучване на солунтогенната линия IBUN 16 3. ОБЩА ЦЕЛ 18 3.1. Специфични цели 18 4. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 19 4.1. Микроорганизми, среда и условия на култура 19 4.2. Кинетика на растежа 20 4.3. Получаване на суров протеинов екстракт 20
4.3.1. Производство на суров протеинов екстракт 20 4.3.2. Определяне на протеини по флуорометричен метод 20 4.3.3. Определяне на ензимната активност 21 4.4. Пречистване на 1,3-пропандиол дехидрогеназен ензим 22 4.4.1. Утаяване на протеини 22 4.4.2. Разделяне и пречистване на ензима 22 4.4.3. Проверка на пречистването 22 4.4.4. Анализ на протеини (PAGE) 23 4.5. Характеризиране на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа 23 4.5.1. Определяне на оптималната температура 23 4.5.2. Определяне на оптималното рН 23 4.5.3. Определяне на кинетичните параметри Km и Vmax 24 4.5.4. Ефект на двувалентни йони 24 4.5.5. Предварителен тест за определяне на молекулната маса 24 4.5.6. Определяне на изоелектричната точка 25 5. РЕЗУЛТАТИ 26 5.1. Метод за получаване на суров протеинов екстракт 26 5.1.1. Работни щамове 26 5.1.2. Кинетика на растежа 26 5.2. Получаване на суров протеинов екстракт 27 5.2.1. Производство на суров протеинов екстракт 27 5.2.2. Ензимна активност 28 5.2.3. Крива на калибриране за NAD + H 29 5.3. Разделяне и пречистване на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа 29 5.3.1. Протеинови валежи 30
5.3.2. Разделяне и пречистване 31 5.3.3. Анализ на протеини (PAGE) 35 5.4. Характеризиране на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа 36 5.4.1. Влияние на температурата върху активността на ензима 36 5.4.2. Определяне на оптималното рН 37 5.4.3. Определяне на кинетичните параметри Km и Vmax 37 5.4.4. Ефект на двувалентни йони върху активността на ензима 38 5.4.5. Предварително изпитване за определяне на молекулната маса 39 5.4.6. Определяне на изоелектричната точка на ензима 40 6. ДИСКУСИЯ 41 7. ЗАКЛЮЧЕНИЯ 51 8. ПРЕПОРЪКИ 52 9. БИБЛИОГРАФСКИ РЕФЕРЕНЦИИ 53 10. ПРИЛОЖЕНИЯ 61 10.1. ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Стандартна крива NAD + H 61 10.2. ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Определяне на ензимната активност 63 10.3. ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Крива на растеж на Clostridium IBUN 158B в RCM среда (Oxoid) 64 10.4. ПРИЛОЖЕНИЕ 4. Крива на растеж на Clostridium IBUN 158 B в среда TGY 65 10.5. ПРИЛОЖЕНИЕ 5. Крива сухо тегло спрямо абсорбция (600 nm) на Clostridium IBUN 158B в среда TGY 67 10.6. ПРИЛОЖЕНИЕ 6. Стандартна крива за определяне на молекулната маса на 1,3-пропандиолдехидрогеназа в полиакриламиден гел при денатуриращи условия 68
1,3-пропандиол дехидрогеназа 39 Фигура 19. Процент на активност на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа срещу действието на хлоридни соли 39 Фигура 20. Оценка на молекулната маса на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа в 10% полиакриламид гелове при денатуриращи условия 40 Фигура 21. NAD + H крива и уравнение на линията в спектрофотометъра Bio-Rad 61 Фигура 22. NAD + H крива и уравнение на линията в четеца TECAN ELISA 62 Фигура 23. Кинетика на необходимото време за получаване на по-висока ензимна активност 63 Фигура 24. Крива на растеж на Clostridium IBUN 158B в RCM 64 Средна Фигура 25. Крива на растеж на Clostridium IBUN 158B в среда TGY 66 Фигура 26. Крива на сухо тегло Vs Абс 600 nm на Clostridium IBUN 158B в TGY 67 среда Фигура 27. Стандартна крива на молекулна маса, използвана за оценка на масата на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа, оцветена с Coomassie Blue 68 Фигура 28. Стандартна крива на молекулна маса, използвана за това Намалете масата на ензима 1,3-пропандиол дехидрогеназа от Zymogram 68