Проучване на структурата на мастните тъкани чрез изчистване на метилсалицилат и 3D изображения (преведено
Обобщение
Тук описваме прост, евтин и бърз метод за почистване за разрешаване на 3D структурата на бялата мастна тъкан на човек и мишка, като използваме комбинация от маркери, за да визуализираме васкулатурата, ядрата, имунните клетки, невроните и липидните капкови протеини, използвайки флуоресцентни изображения.
Резюме
Въведение
Затлъстяването се характеризира с увеличаване на масата на мастната тъкан и се е превърнало в основен проблем на общественото здраве по целия свят, тъй като хората със затлъстяване са изложени на повишен риск от развитие на сърдечно-съдови заболявания, диабет тип 2, чернодробни заболявания и някои видове рак.
Основна физиологична функция на мастната тъкан е да модулира холеостазата на глюкозата и липидите в цялото тяло 1, 2. По време на периода на хранене адипоцитите (т.е. основните клетки на мастната тъкан) съхраняват излишната глюкоза и липиди, осигурени от хранене, в триглицериди. По време на гладуване адипоцитите разграждат триглицеридите до нестерифицирани мастни киселини и глицерол, за да поддържат нуждите на тялото от енергия. По време на развитието на затлъстяването мастната тъкан се разширява, увеличавайки размера (хипертрофия) и/или броя (хиперплазия) на адипоцитите 1, за да увеличи капацитета му за съхранение. Когато разширяването на мастната тъкан достигне своята граница, силно променлива константа сред пациентите, останалите липиди се натрупват в други метаболитни органи, включително мускулите и черния дроб 3, 4, което води до тяхната функционална недостатъчност и инициира свързани сърдечно-метаболитни усложнения със затлъстяване 15. Следователно идентифицирането на механизмите, които управляват разширяването на мастната тъкан, е ключово клинично предизвикателство.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Този протокол беше тестван и валидиран за всички депозити на мишки и човешка бяла мастна тъкан. Мастните тъкани на хора и мишки бяха събрани в съответствие с европейските закони и одобрени от френския и шведския етичен комитет.
1. Фиксиране на бяла мастна тъкан на мишка и човек
2. Пермеабилизация и насищане на бяла мастна тъкан на мишка и човек
3. Процедура за оцветяване на бяла мастна тъкан на мишка и човек
4. Процедура за почистване на бяла мастна тъкан на мишка и човек
5.3D-конфокално изобразяване на прозрачна бяла мастна тъкан
- Прехвърлете тъканта в метална камера за изображения, снабдена със стъклено дъно (вж Таблица на материалите)под химически абсорбатор и напълнете камерата с пресен метил салицилат.
ЗАБЕЛЕЖКА: За да закрепите тъканта на място и по този начин да я предотвратите да се носи или да се движи настрани в камерата, нанесете множество 18 мм кръгли стъклени капаци (вижте Таблица на материалите)върху плат, когато се монтира на камерата. - Поставете камерата за изображения върху обърнат конфокален микроскоп.
- Изобразяване на тъканта с помощта на обектив с ниско увеличение (например 4х обектив), за да се генерират няколко cm 3 3D карти на цялата мастна тъкан или пробата от човешка тъкан.
- Изберете няколко области за вземане на проби от тъкани при по-голямо увеличение. Обикновено използвайте 20x въздушен обектив с голям обсег, който осигурява добро съотношение между резолюция и дълбочина. Придобиваме големи мозаечни изображения с z-стекове с дълбочина между 600 и 2000 m.
ЗАБЕЛЕЖКА: Използвайте обектив на дълги разстояния, за да пробиете тъканта.