Производно на производни клетки на невронния гребен от протокол на човешки плурипотентни стволови клетки

Обобщение

Резюме

Въведение

Клетките на нервния гребен (NC) се появяват по време на неврулация на гръбначни животни между епидермиса и невронния епител. Те се размножават и мигрират широко в развиващия се ембрион и пораждат впечатляващо разнообразие от видове потомствени клетки, включително кости/хрущяли, черепно-лицеви скелети, сензорни нерви, клетки на Шван, меланоцити, гладки мускулни клетки, чревни неврони, автономни неврони, хромафинови клетки, сърдечни преградни клетки, зъби и клетки на надбъбречната жлеза/щитовидната жлеза 6. Следователно, NC клетките са привлекателен клетъчен тип за полето на стволовите клетки и са важни за моделирането на редица заболявания, като болестта на Hirschsprung 7, фамилна дисавтономия 8, т.к. както и ракови заболявания като невробластом 9. Освен това те предлагат възможност за изучаване на аспекти на човешкото ембрионално развитие in vitro.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Подготовка на хранителни среди, покрити плаки и поддържане на hPSC

Подготовка 1.1 Среда

Забележка: всички филтриращи среди за стерилизация и се съхраняват при 4 ° C на тъмно до 2 седмици. Номерата на имената на реагенти за компанията и каталога са посочени в Таблица на материалите.

  1. DMEM/10% FBS: Комбинирайте 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml пеницилин/стрептомицин и 5 ml L-глутамин.
  2. HES-среда: Комбинирайте 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-глутамин, 5 ml пеницилин/стрептомицин, 10 ml минимален разтвор на незаменими аминокиселини MEM, 1 ml β-меркаптоетанол. Добавете 10 ng/ml FGF-2 след филтриране на средата.
    ВНИМАНИЕ: β-меркаптоетанолът е токсичен, избягвайте вдишване, поглъщане и контакт с кожата.
  3. KSR-диференцираща среда: Комбинирайте 820 ml нокаут DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-глутамин, 10 ml пеницилин/стрептомицин, 10 ml MEM минимален разтвор на незаменими аминокиселини и 1 ml β-меркаптоетанол.
  4. N2-диференцираща среда: Разтворете 12 g прах в 980 ml DMEM/F12 dH 2 O, добавете 1,55 g глюкоза, 2 g натриев бикарбонат и 100 mg APO човешки трансферин. Смесете 2 ml dH2O с 25 mg човешки инсулин и 40 µl 1 N NaOH, добавете разтворения разтвор към средата. Добавете 100 l путресцин дихидрохлорид, 60 l селенит, 100 l прогестерон и донесете обема до 1 литър с dH 2 O.

1.2 Покривни културни плочи

1.3 Поддръжка на hPSC

Забележка: hPSCs се поддържат в 0,1% желатин и митотично инактивирани миши ембрионални фибробласти (MEFS) в HES-среда, допълнена с 10 ng/ml FGF-2, както е описано по-горе 10,12. Клетките трябва да се разделят на всеки 6-8 дни.

  1. Покрийте 10 cm съд с 8 ml 0,1% желатин (в 1x PBS без магнезий или калций) при RT за 5 минути.
  2. Размразете бързо замразените MEFs на водна баня с температура 37 ° C. Добавете 1 милион MEFs към 10 ml DMEM/10% FBS.
  3. Аспирирайте желатина и покрийте клетките. Инкубирайте при 37 ° С за поне 6 часа.
  4. Аспирирайте DMEM/10% FBS от подготвената MEF плака, измийте плаката с 1x PBS веднъж и добавете 10 ml HES-среда, допълнена с 10 mM Y-27632 дихидрохлорид. Оставете средата да се затопли до 37 ° C за 20 минути.
    Забележка: За ръчно разделяне на hPSC се използва качулка с ламинарен поток с вграден микроскоп. Клетките обаче могат да бъдат преминавани чрез подходящи алтернативни методи.
  5. Под качулка с ламинарен поток с вграден микроскоп отделете отделни колонии с помощта на мобилен кран и им позволете да плават.
  6. Използвайте спринцовка от 1 ml, за да аспирирате плаващите колонии и да ги изпратите в хладната, топла MEF чиния. Прехвърлете около една четвърт от клетките в новия съд. Инкубирайте при 37 ° C.
  7. Хранете клетките ежедневно с прясна HES среда.