Правила за взаимодействие на кавеолин kv1
Субекти
Обобщение
Въведение
Тук изследваме влиянието на Cav върху ориентацията на липидния сал на каналите Kv1, като анализираме функцията на възможен консервиран CBD мотив в семейството Shaker. Както Kv1.3, така и Kv1.5 са насочени към липидни салове, но само Kv1.3 ефективно взаимодейства с Cav чрез CBD, където тази асоциация е от съществено значение за локализацията на каналите в тези домейни. Освен това поведението и активността на Kv1.3 бяха обусловени от присъствието на Cav1. Следователно, наличието на CBD близо до T1 на Kv1.3 има важни функционални последици за физиологията на канала Kv1.3.
Резултати
Диференциална кавеолинова зависимост на Kv1.3 и Kv1.5 разделяне на липидни салове
Общо протеиновите лизати на HEK Cav1, получени 24 часа след трансфекция с посочения канал (маркиран с YFP), се имунопреципитират срещу кавеолин. Проби, разделени чрез SDS-PAGE и имуноблотирани (IB) срещу GFP (канал) и антитела срещу кавеолин. ( ДА СЕ ) Схематични диаграми на пресечени канали Kv1.3 и химери Kv1.3-Kv1.5. Kv1.3 домейни: бели варели и черни линии. Kv1.5 домейни: сиви бъчви и сиви линии. ( Б. ) Изходни материали. Горният панел, филтрите бяха имуноблотирани срещу GFP (Канали). Долен панел, филтри бяха тествани срещу Cav, за да се демонстрира Cav имунопреципитация. ( ° С ) Имунопреципитати. Не се наблюдава имунопреципитация при липса на антитяло (IP-).
Изображение в пълен размер
Кавеолин 1 взаимодейства с Kv1.3 чрез CBD подпис, разположен в N терминала на канала
Изолирани липидни салове, направени в HEK Cav- (леви панели) и HEK Cav1 (десни панели), изразяващи Kv1.3CBD ( ДА СЕ ) и мутантни Kv1.5CBD канали ( Б. ) (166 FQRQVWLLF 174 до AQRQVGLLA и 232 FQRQVWLIF 240 до AQRQVWLIF 240 до AQRQVWLIF 240). ( ° С ) HEK Cav1, експресиращ Kv1.3 или Kv1.3CBD, се имунопреципитира срещу кавеолин (IP: Cav1) в присъствието (+) и отсъствието (-) на кавеолиново антитяло. Пробите се разделят чрез SDS-PAGE и се имуноблотират срещу Kv1.3 (IB: Kv1.3) и кавеолин (IB: Caveolin) SM: изходен материал; SN: супернатант; PI: имунопреципитат.
Изображение в пълен размер
Не открихме взаимодействия между Kv1.5 и Cav1; обаче, когато конвертираме предполагаемата Kv1.5 CBD в тази на Kv1.3 (Kv1.5I239L), наблюдаваме положителна Cav1 ко-имунопреципитация Фиг. S4. Освен това, доказателствата сочат, че Kv1.5 би могъл индиректно да взаимодейства с кавеолини чрез образуването на супрамолекулни комплекси, включително SAP97 33, 34. SAP97 (свързаният със синапс протеин 97) е член на семейството на мембранно-асоциираната гуанилат киназа (MAGUK), което включва и PSD95 (протеин на постсинаптичната плътност 95). Следователно, ние експресираме Kv1.5 в присъствието и отсъствието на PSD95 в HEK Cav1 клетки. В този сценарий Kv1.5 се ко-имунопреципитира с Cav1, само в присъствието на PSD95 (фиг. S4). Следователно, нашите данни показват, че докато пълната цялост на Kv1.3 CBD е достатъчна за взаимодействие с Cav1, Kv1.5 изисква помощни протеини.
Дискусия
Доказателствата показват, че Kv1.3 е насочен към специфични мембранни места 35, 36, а изместванията на местоположението имат патологични последствия 37. Нашето проучване подчертава основния механизъм на разделяне на мембранната повърхност на канала Kv1.3. Тук докладваме, че сред каналите Kv1 (Shaker) само Kv1.3 и Kv1.5 са насочени значително към липидни салове. Въпреки това, докато Kv1.5 плаваемостта е независима от експресията на кавеолин, концентрацията на Kv1.3 липидни салове се увеличава по зависим от дозата кавеолин начин. Това има физиологично значение, тъй като е потвърдено при BMDM от Cav1 -/- мишки. Освен това колокализацията на кавеолиновия канал е по-висока с Kv1.3, отколкото с Kv1.5. И накрая, ясно идентифицирахме CBD, който се намира в N-терминалния домейн на Kv1.3 и е елементът, отговорен за взаимодействието Cav1 и местоположението на липидния сал на канала. Тъй като ориентацията на липидните салове е предложена като механизъм за регулиране на йонните канали, 1, 38 нашите резултати допринасят за това разширяващо се поле.
В обобщение, нашите резултати помагат да се изяснят механизмите, които насочват Kv1 каналите към специфични повърхностни микродомейни, които участват в фина настройка на клетъчните реакции. За разлика от други Kv1 невронални канали, Kv1.3 взаимодейства с кавеолин чрез CBD, разположен в N-терминалния домейн на канала, съседен на първия трансмембранен сегмент и в непосредствена близост до T1 домена и мястото на свързване на Kvβ. Тази асоциация насочва Kv1.3 към кавеоларни структури, които регулират както динамиката, така и активността на мембраната на канала.
Методи
Експресионни плазмиди и насочена към сайта мутагенеза.
Плъх Kv1.3 в pRcCMV е осигурен от TC Holmes (Калифорнийски университет, Ървайн, Калифорния). Плъх Kv1.1 и Kv1.4 в pGEM7 и човешки Kv1.5 в pBK конструкции бяха субклонирани в pEYFP-C1 и pECerulean-C1 (Clontech). Химерите Kv1.3/Kv1.5 бяха генерирани в каналите pEYFP-rKv1.3 и pEYFP-hKv1.5 чрез вмъкване на сайтовете BglII и EcoRI в N и C домейните на терминала на каналите. Мутантите бяха генерирани с помощта на комплекти за мутагенеза, насочени към сайта QuikChange (Stratagene). LoopBAD последователността (BAD, приемник на биотин домен) беше вмъкната в първия извънклетъчен цикъл на pEYFP-Kv1.3 в рамките на съществуващ NruI сайт за конструкцията rKv1.3LoopBAD. E. coli Биотин лигаза, съдържаща конструкцията pBtac_BirA, беше използвана, както е описано по-рано 54. Плъх Cav 1 в pECerulean-C1 е предоставен от JR Martens (Медицински факултет на Университета на Флорида). Cav1 се вкарва в pcDNA3 чрез смилане на Cav-pECerulean (HindIII-BamHI). Конструкциите бяха проверени чрез секвениране.