Откриване на Mycobacterium avium paratuberculosis при кози, разположени в полусуха зона в
Използван е полеви щам на Mycobacterium avium paratuberculosis, дарен от д-р Марко Антонио Сантилан от CENID INIFAP Microbiology, този щам е използван като положителна контрола в PCR анализа.
В края на 2008 г. бяха събрани 139 проби от кръв и кръв от кози на възраст между 1 и 3,5 години в общността La Mesilla, в община Tecozautla. Тази община се намира в щата Хидалго, между паралели 20 ° 48 'ширина, -99 ° 67' дължина, на надморска височина от 1890 метра. В тази област има производители от селски тип с производства с ниско ниво на техника с малко превантивни медицински практики, а производството на кози е широко. Работили са с 8 различни стада, всички заподозрени в Карта. Фекалиите се поставят в торбички, а кръвните проби във вакуумни епруветки без антикоагулант. След събирането на пробите се поставят в термос с лед за тяхното консервиране и последващ анализ в лабораторията по селскостопанска микробиология на Университетския автоном Metropolitana Xochimilco Unit.
Петно на Ziehl-Neelsen (ZN)
Всички проби на изпражненията бяха анализирани с помощта на специално петно, устойчиво на киселина и алкохол (17), което основно разкрива наличието на киселини, устойчиви на киселина и алкохол, съвместими с Map.
Извличане на ДНК от проби от изпражнения
Вложен PCR за откриване на карта
За първото усилване бяха използвани външните грундове IS 900-F (5 'TGATCTGGA CAATGACGGTTACGGA 3') и IS 900-R (5 'CGCGGCACGGCTCTTGTT 3'), които усилват продукт от 563 bp (18). PCR реакцията съдържа: 45 µl PCR смес (22mM Tris-HCl pH 8.4, 1.65 mM MgCl 2, 220 uM dGTP, 220 dATP, 220 uM dCTP, 220uM dTTP, 2 U Taq полимераза (Promega) 300 pM от първата IS900-F, 300 рМ от първия IS900-R и 2 µl ДНК проба. Условията на PCR циклите бяха: първоначална денатурация от 94 ° C за 3 минути, след което да продължи с 35 цикъла от 94 ° C за 1 минута, 56 ° C за 1 минута и 72 ° C за 1 минута. За второто усилване (вложена PCR) бяха взети 5 µl от амплифицирания продукт и добавени към нова PCR реакция, вече с вътрешни праймери IS 900 -IF (5 'GCCGCGCTGCTGGAGTTGA 3') и IS 900-IR (5 'AGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTG 3'), които генерират продукт от 210 bp, условията на този PCR цикъл са еднакви. Продуктите, получени от това второ усилване, се визуализират чрез електрофореза върху 1% агароза гелове, оцветени в етидиев бромид (18).
Използвани са само серуми от животни, принадлежащи към стадото с положителни усилвания за Map. За извършване на техниката беше използвана търговска система «Паратуберкулозен скрининг Ab kit» (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME) (19), следвайки спецификациите на производителя.
Извличане на ДНК от проби от изпражнения
Процедурата за екстракция и визуализация на ДНК е извършена върху 139 проби. От тези проби само 54 са имали ясно присъствие на ДНК. На (Фигура 1) се наблюдава ДНК, извлечена от някои проби, както може да се види на тази фигура, получената ДНК показва леко разграждане, което не е повлияло развитието на PCR техниката, също е било възможно да се оцени в някои проби наличието на РНК, което е нормално предвид използвания протокол за екстракция.
Петно на Ziehl-Neelsen (ZN)
При анализа на пробите чрез ZN оцветяване, 6 от 139 анализирани проби са положителни за оцветяване, т.е. устойчиви на киселина и алкохол бацили, съвместими с Map (Фигура 2, Таблица 1). За стадо А 4-те положителни проби представляват 20%, докато за стадо D са наблюдавани 4% от пробите, положителни за оцветяване, и накрая в стадо Н е получена положителна проба за оцветяване, което представлява 8,3% от общото стадо.
Преди използването му с пробите, PCR техниката беше стандартизирана, като се използва ДНК от щам Map. Тази ДНК се използва във всички анализи като положителна контрола. От всички анализирани проби, 7 са имали положителни резултати при вложен PCR (Фигура 3). Трябва да се отбележи, че тези 7 проби са от стадо А, съвпадащи с три положителни проби за ZN оцветяване и пет за ELISA (Таблица 1). Тези седем проби представляват 5,03% от общите проби; и 35% от общите проби от стадо 1, където има по-висока честота на проби, положителни за Map .
Анализ на серуми чрез ELISA
Чрез PCR и ZN оцветяване са анализирани само серумите от положителните стада на картата, получените резултати са показани в Таблица 2, където са включени отрицателни и положителни референтни стойности. Използвайки тези данни, беше установена гранична точка от 0,438, както беше предложено от Kurstak (20). Като се има предвид тази стойност, пробите A3, A18, A8, A11 и A16 са положителни. В случая на проби A11 и A18 резултатите съвпадат с тези, получени при PCR теста.
Паратуберкулозата е инфекциозно заболяване с разпространение в световен мащаб, което се отразява негативно на добитъка. В Мексико ситуацията по отношение на честотата на това заболяване е неизвестна и има малко съобщения за дребни преживни животни. В тази работа се съобщава за присъствието на Map в стадо кози в Tecozautla, Hidalgo, което е първият доклад на Map в тази област. Преди това Чавес и др. (8) проведоха търсене на този микроорганизъм, използвайки различни методологии в козе стадо, разположено в Мексиканската долина. Тази работа, заедно с предишната, представлява първите доклади на Карта при козите.
Различни методологии са създадени за определяне на присъствието на инфекциозен агент в популация, логично първата е изолирането; обаче за много патогенни микроорганизми, особено тези от рода Mycobacterium spp., изолирането е трудно и представлява риск, тъй като някои видове от този род се считат за зоонозни (10,18). В тази работа бяха използвани директни и индиректни методи; в първия случай беше решено да се използва молекулярен метод, базиран на PCR техниката, който разкрива присъствието на ДНК в клинични проби. Този метод има и предимството, че като не работи директно с агента, това е безопасен метод. По тази методология бяха идентифицирани седем положителни проби от общо 139. Положителните проби бяха от животни, принадлежащи към същото стадо, където бяха изследвани 20 проби. Чавес и др. (8) работейки с едно стадо от 27 животни, те са постигнали изолация в 4 случая и са отнели приблизително 14 седмици; в нашия случай идентифицирането на положителни животни изискваше само два дни.