МОЛЕКУЛАРЕН АНАЛИЗ НА ДВУДЕНАЛНАТА МИКРОБИОТА НА ДЕЦА И ВЪЗРАСТНИ С И БЕЗ ЦЕЛИАЧНА БОЛЕСТ; ACAD
Esther Nistal1, Jenifer Pérez-Andrés1, Alexandra R Herrán1, Alberto Caminero4, Santiago Vivas3, José M Ruiz de Morales2, Ricardo Vicente Ullan6 и Javier Casqueiro 1,
Зона за микробиология, Факултет по биологични и екологични науки, Университет в Леон. Отделение за 2 имунология и 3 гастроентерология, болница Леон. 4 Институт по молекулярна, геномна и протеомна биология (INBIOMIC) и Институт по биомедицина (IBIOMED) Campus de Vegazana, Университет в Леон. 6 Институт по биотехнологии в Леон. Лъв.
РЕЗЮМЕ
Глутенът, много често срещан компонент в човешката диета, е способен да активира патогенезата на целиакия при генетично предразположени индивиди. Въпреки че ролята на човешките храносмилателни ензими върху глутеновите протеини е много добре известна, има голяма липса на знания за ролята на чревната микробиота в нейния метаболизъм. Целта на това проучване беше да се анализира молекулярно дуоденалната микробиота, която участва в метаболизма на глутена, използвайки PCR-DGGE. За това дуоденалните биопсии на деца и възрастни се култивират в хранителна среда (MCB), която съдържа глутен като единствен източник на азот.
Анализът чрез PCR-DGGE показа, че дуоденалната микробиота, способна да расте в MCB, е доминирана от Streptococcus salivarius и S. oralis. Въпреки това бяха открити и други родове като Lactobacillus, Gemella, Haemophilus, Clostridium, Granulicatella и Staphylococcus, макар и с по-ниска честота. Следователно, въпреки че няма електрофоретичен профил, който може да бъде свързан със заболяването, се наблюдава голямо разнообразие от дуоденални бактерии, които могат да участват в метаболизма на глутена. Необходими са повече проучвания за подробна характеристика на дуоденалната микробиота, свързана с метаболизма на глутена, за да се разгледат възможните терапевтични алтернативи в бъдеще.
ВЪВЕДЕНИЕ
Целиакията (CD) е хронично възпалително заболяване на червата, което се проявява при генетично чувствителни индивиди и се причинява от неподходящ имунен отговор на глутенови протеини (1, 2). Понастоящем единственото ефективно лечение на CD е пълното елиминиране на глутена от диетата през целия живот на пациента (3) .
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Пациенти и проби от дванадесетопръстника
Културна среда и културни условия
За изолирането на микроорганизмите от биопсичната култура се използва течната среда MCB, проектирана в нашата лаборатория, която съдържа глутен като единствен източник на азот: 2mM CaCl2, 2mM ZnSO4, 2% глюкоза, 0,1% Tween 80 (v/v ), 20 цМ FeCI3, глутен (Sigma-Aldrich) 3% и глутен, усвоен с 0,5% пепсин. РН се регулира до 6.5 с фосфатен буфер (1%). Средата беше стерилизирана в автоклава в продължение на 20 минути при 121 ° С. Впоследствие, чрез нанасяне на покритие, беше проверено, че средата е напълно стерилна.
3% глутеновият смилаж (100 mL) се получава чрез инкубиране на 3 g глутен с 1 g пепсин при рН 2, коригирано с HCl (10М). Сместа се инкубира в продължение на 2 часа при 37 ° С с разклащане (250 rpm). След това рН се повишава до 6,5 с NaOH (1М) и впоследствие се стерилизира при 121 ° С в автоклава за 20 минути.
Биопсията се инокулира в колба с 10 ml хранителна среда и се инкубира в продължение на 48 часа при 37 ° С с разклащане (100 rpm) при микроксични условия.
Извличане на ДНК от култури
биопсия и PCR амплификация
Извличането на геномна ДНК от биопсични култури се извършва в съответствие с инструкциите на протокола за екстракция на ДНК на SpeedTools Tissue DNA (Biotools, Spain). Концентрацията на ДНК се определя с помощта на спектрофотометъра NanoDrop ND-1000 (Saveen & Werner, Limhann, Швеция).
За да се характеризира молекулярно дуоденалната микробиота, две променливи области с различен размер на 16S рибозомната ДНК се усилват чрез PCR, за да се сравнят получените резултати с двата фрагмента. За амплифицирането на 16S рРНК гените бяха използвани две двойки праймери. двойката олигонуклеотиди HDA1GC и HDA2 (16), които усилват фрагмент от около 200 bp, съответстващ на V3 областта на 16S rDNA и двойката праймери F968GC и R1401 (17), които усилват фрагмент от приблизително 450 bp от V6- регион 16S рДНК V8. За тези усилвания е използван търговският комплект iProof High-Fidelity Master Mix (BioRad). PCR програмата, която беше използвана за този комплект, се състоеше от първоначална денатурация от 98 ° C за 30 секунди и оттук нататък 30 цикъла със следните температури: 98 ° C за 10 секунди, 56 ° C или 55 ° C за 30 секунди и 72 ° C, 30 секунди. Програмата за PCR завършва с удължаване при 72 ° C за 10 минути.
Анализ на микробиотата, получена от културата на дуоденални биопсии чрез денатурираща градиентна електрофореза (DGGE)
Разликите в броя на видовете между различните групи популации бяха анализирани с помощта на теста "хи-квадрат" (приложена корекция на Йейтс). Установена е статистическа значимост за р стойности
РЕЗУЛТАТИ
Молекулярен анализ чрез PCR-DGGE
от V3 региона на 16S рДНК
Фигура 1 показва профилите DGGE, получени от PCR продуктите на V3 региона, като се използва ДНК на дуоденалните биопсични култури като шаблон. Различните профили показват между 1 до 5 интензивни и добре разрешени ленти. Останалите ленти бяха слаби или подобни на петна. Не се наблюдават статистически значими разлики по отношение на броя на лентите между електрофоретичните профили на здрави индивиди и тези на пациенти с целиакия, както активни, така и лекувани, нито разлики, свързани с възрастта.
Няколко ленти бяха избрани за извършване на тяхната молекулярна идентификация. PCR продуктите, които бяха идентифицирани чрез секвениране от лентите DGGE, са показани в таблица I. За да завърши молекулярната идентификация на всяка от секвенираните ивици, беше извършен филогенетичен анализ. Честотата на различните видове, открити чрез PCR-DGGE, е показана в таблица II. В рамките на различните идентифицирани видове преобладават Streptococcus salivarius и S. oralis, които са открити на практика при всички индивиди, както деца, така и възрастни, независимо от заболяването. За разлика от тях, Bacillus cereus, Haemophilus influenza, Lactobacillus mucosae и Staphylococcus epidermidis са открити само от биопсии на култури при деца, но с много ниска честота. От културата на биопсии от възрастни индивиди, видове като Clostridium perfringens, Granulicatella elegans или G. adiacens, Lactobacillus crispatus и L. gasseri също се появяват с ниска честота. .
Молекулярен анализ чрез PCR-DGGE на V6-V8 региона на 16S рДНК
PCR продуктите, генерирани от праймерите F968GC/R1401, се разделят с DGGE върху 8% акриламид/бисакриламидни гелове в денатуриращ градиент от 40-60% урея и формамид. Както може да се види на фигура 2, моделите на DGGE ленти, получени с универсалните праймери, съответстващи на V6-V8 областта на 16S rDNA, показват много малко ленти (между 1 до 4 ленти), но по-голямата част са добре решени. Нито един електрофоретичен профил не може да бъде свързан със заболяването. Не се наблюдават и разлики по отношение на броя на лентите, присъстващи в електрофоретичните профили на деца и възрастни, или между здрави и болни.