Клетъчната терапия с помощта на експресиращи клетки mir-302-367 потиска растежа на

Субекти

Обобщение

Главен

Глиобластомите (GBM) са най-честата форма на първични мозъчни тумори, които могат да засегнат възрастни пациенти на всяка възраст. Тези силно васкуларизирани и инфилтриращи тумори са устойчиви на съвременните терапевтични терапии и най-често водят до фатален изход за по-малко от 18 месеца. Текущото лечение с лъчева терапия и използването на темозоломид осигуряват по-добри резултати за пациенти с метилиран профил на гена MGMT. 16, 17 Въпреки това, ефикасността на това лечение, дори с използването на антиангиогенни молекули (бевацизумаб), е ограничена и този тумор остава нелечим. Агресивното поведение на GBM, включително резистентност към текущи лечения и туморни рецидиви, се дължи на наличието на GBM-подобни прогениторни клетки (GSC). 18, 19 Следователно, трябва да бъдат спешно разработени нови методи за лечение, които конкретно са насочени към GBM-подобни стволови клетки, за да се унищожат тези нелечими тумори.

Използвайки подход за профилиране на микроРНК в колекция от първични култури, получени от пациент на глиомоподобни клетки (GSC), показахме, че клъстерът miR-302-367 ангажира CMS в необратимо диференцирано състояние и блокира способността им да инициират и прогресират тумори in vivo. 20 В настоящото проучване ние показваме, че GSC, получен от пациент, проектиран да стабилно и конститутивно експресира клъстера miR-302-367, е успял да освободи екзозоми, съдържащи miR-302-367. Тези екзозоми бяха бързо интернализирани от съседния GSC, което доведе до промяна на свойствата на пролиферацията и пролиферацията по зависим от miR-302-367 начин. Ортотопичният ксенотрансплантат на клетки, експресиращи miR-302-367, заедно с GSC ефективно променя развитието на тумора в мозъка на мишки, демонстрирайки терапевтичния си потенциал за блокиране на туморни рецидиви. Нашето проучване предполага, че клетъчната терапия може да бъде иновативно решение срещу рак.

Резултати

GSC, експресиращ групата miR-302, потиска експресията, пролиферацията и инфилтрацията на SHH и SOX2 по паракринен начин

помощта

Изображение в пълен размер

Клетките TG1-miR-302 и GB1-miR-302 секретират екзозоми, способни да потискат потенцията и пролиферацията на GSC

За да се идентифицират молекулите, отговорни за антитуморния ефект, беше извършена ултрафилтрация въз основа на размера на кондиционираната среда. Отбелязваме, че фракция с високо молекулно тегло (

Изображение в пълен размер

Таблица в пълен размер

Клъстерът miR-302 се пренася в съседни клетки чрез екзозомна секреция

Изображение в пълен размер

Таблица в пълен размер

Експресията на miR-302 групата в GSC насърчава паракринния супресорен ефект на тумора in vivo

Резултатите от този подход, който получихме при мишки, са принципно доказателство, че клетъчната терапия за лечение на рак заслужава да бъде разгледана. В допълнение към GSC, други екзозомосекретиращи клетки, като макрофаги, могат да бъдат изолирани от пациенти и генетично модифицирани, за да експресират стабилно терапевтични РНК молекули за лечение на тумори.

Трансплантацията на тези клетки директно на мястото на тумора по време на операцията би позволила продължително приложение на екзозоми на супресор на тумора на местно ниво, избягвайки тежки и стресиращи периодични инжекции на екзозоми в пациента.

В заключение вярваме, че нашето проучване ще предизвика интерес към използването на клетъчна терапия за in situ доставка на терапевтични екзозоми за насочване на човешки GBM.

материали и методи

Електронен микроскоп

Динамично разсейване на светлината (DLS)

Измерването на DLS беше извършено със Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK). Пробите се разреждат в 100 μl 1 × PBS. Извършени са 3 × 12 серии измервания, използвайки стандартните настройки (индекс на пречупване = 1,33, температура = 25 ° C, вискозитет = 0,8882 и диелектрична константа = 79,0). Резултатите са начертани с помощта на OriginPro 2015.

Екстракция на микровезикули.

10 6/ml GSC в определена среда без микровезикули (NS34 + среда, Fareh et al.). След 72 часа GSCs бяха отстранени чрез центрофугиране (276 xg, 4 ° С, в продължение на 5 минути) и кондиционираната среда беше събрана, филтрирана през 0.2 μm филтър (Millipore, Fontenay sous Bois, Франция) и концентрирана. като се използва 100 kDa Amicon Ultra центробежен филтър (Millipore,). Концентрираната кондиционирана среда се използва за пречистване на микровезикулите чрез ултрацентрифугиране при 200 000 х g за 110 минути.

Реактиви и антитела.

Реагентите за клетъчна култура, включително DMEM, F12, глутамин, хепес, натриев бикарбонат, N2, G5 и B27, комплект за клониране на pENTR, LR клоназа II, обратна транскриптаза Superscript II, DiIC16 (3), DiO16 (3) и TRIzol са закупени реактиви от Life Technologies (Cergy Pontolse, Франция). Феталният телешки серум (FCS) е закупен от Hyclone (Brebières, Франция), а комплектът Exoquick е закупен от Ozyme (St. Quentin в Yvelines, Франция). Hoechst 33342 и Actinomycin D са доставени от Sigma (St. Quentin Fallavier, Франция), а Micromount Mounting Media е закупен от Leica Biosystems (Nanterre, Франция). Комплектът за микроРНК Taqman за обратна транскрипция, Universal Taqman PCR Master Mix и сондите Taqman са закупени от Applied Biosystems (Villebon sur Yvette, Франция). Подобрен реагент за откриване на хемилуминесценция е закупен от Bio-Rad (Marnes la Coquette, Франция).