Изолиране, характеризиране и пречистване на макрофаги от тъкани, засегнати от
Обобщение
Този протокол позволява на изследователя да изолира и характеризира резидентната макрофагална тъкан в различни възпалени тъкани на тюлени, извлечени от индуцирани от диета модели на метаболитни нарушения.
Резюме
Въведение
Модели на мишки са използвани за изследване на динамиката на човешките заболявания. Правилната изолация на резидентни клетки от тъканта на мишки в болно състояние може да осигури платформа за разбиране на молекулярния и клетъчния принос към патогенезата на заболяването Едно разстройство, което е от жизненоважно значение, е затлъстяването. Честотата на затлъстяването продължава да се увеличава в световен мащаб, паралелно с инсулиновата резистентност и захарен диабет тип 2, сърдечно-съдови заболявания и мастни чернодробни заболявания 2, 3. Прекомерната консумация на хранителни вещества е по-пристрастна от намаляването на физическата активност, причиняващо променени сигнали от мастната тъкан, което може да промени клетъчната среда на други периферни тъкани като черния дроб и аортата 4. Такова нарушаване на метаболитната хомеостаза води до хронично нискостепенно системно възпаление на 5 .
Класическото активиране на резидента на аортата и черния дроб, както и набирането им в макрофаги бяла мастна тъкан (WAT), е показано не само да инициира дисрегулация на метаболитните сигнали, но и да поддържа възпаление 6, 7. Фенотипната и функционална хетерогенност на макрофагите е силно свързана с патогенезата на затлъстяването, свързана със съпътстващите заболявания. Динамичната пластичност на поляризацията на макрофагите позволява на тези клетки да проявяват разнообразие от активирани фенотипове, които координират прогресията и разрешаването на възпалението. Докато класически активираните макрофаги (М1) участват в разпространението на възпалението, алтернативно активираните макрофаги (М2) са свързани с разрешаване и възстановяване на тъканите 9, 10 .
Докато тялото претърпява метаболитен стрес, бялата мастна тъкан се натрупва необичайно. Разширената мастна тъкан привлича и задържа възпалителни клетки, които дълбоко променят нормалната функция на адипоцитите, за да насърчат инсулиновата резистентност, хипергликемия и захарен диабет тип 2, в крайна сметка инсулинова резистентност или хипергликемия 11, 12. Успоредно с това, ремоделиране на бяла мастна тъкан в отговор на възпалителни сигнали чрез инфилтриране на класически активирани макрофаги (АТМ) на мастна тъкан (M1) от 13, 14. Този многоклетъчен орган упражнява каскада от сигнали, които нарушават нормалната функция на други органи на тялото като аортата и черния дроб 4 .
Черният дроб е метаболитна електроцентрала, която се адаптира в отговор на дразнители от строго нерегулиран WAT 15. Чернодробните макрофаги или Kupffer клетки, в отговор на метаболитните промени, отделят възпалителни цитокини, които трансформират както паренхима, така и непаренхимния клетъчен фенотип и насърчават ремоделирането на тъканите. Натрупването на чернодробни липиди, възпаление, прекомерни отлагания на извънклетъчен матрикс, некроза и евентуална загуба на функция следват възпалителни обиди, допринасящи за широкия спектър от увреждания на черния дроб, свързани с неалкохолна мастна чернодробна болест .
Успоредно с нарушената WAT и чернодробната функция, големите артерии натрупват липиди в артериалната стена, докато тялото претърпява хроничен метаболитен стрес 19. Артериалното натрупване на липиди задейства секрецията на хемокин от активирани ендотелни клетки и последващо набиране на моноцити 20. Веднъж наети, моноцитите се размножават, диференцират, поглъщат липопротеини и се превръщат в пенообразни клетки. Атерогенезата се инициира и поддържа от провъзпалителната активност на вербувани и натоварени с липиди макрофаги, пребиваващи в тъканите. Поддавайки се на извънклетъчни и вътреклетъчни стресови сигнали, предадени в тази атерогенна микросреда, тези макрофаги след това участват в сигнална каскада за апоптоза. Тъй като тези пенообразни клетки умират, те допринасят за тяхното съдържание на липиди, което запълва некротичната основа на лезията, което след това води до разкъсване на плаката, инфаркт на миокарда и инсулт.
Колективно хетерогенността на фенотипите на макрофагите частично организира затлъстяването, предизвикано от възпалителни промени в нормалните тъкани като WAT, черния дроб и аортата 8, 21. Характеризирането на вербувани и резидентни макрофаги може да даде представа за потенциалните молекулни цели, които манипулират фенотип 1 на макрофагите. За да се характеризират ефективно макрофагите в индуцирани от затлъстяването възпалени тъкани, чрез клетъчно разлагане може да се получи едноклетъчна суспензия. Такива протоколи за дисоциация трябва да бъдат ефективни при достатъчно разграждане на съединителната тъкан, като същевременно минимизират имунната клетъчна смърт и осигуряват оптимално клетъчно представяне. Ензимната смес зависи от вида на тъканта и нейния структурен състав. Устойчивите тъкани като аортата изискват по-висока ензимна активност в сравнение с черния дроб и WAT, за да се постигне дисоциация на тъканите. От клетъчната суспензия резидентните макрофаги могат да бъдат еднозначно характеризирани или изолирани за по-нататъшен анализ надолу по веригата, като транскрипционно профилиране.