Дисекция и анализ надолу по веригата на ембриони на зебрата в ранните етапи на протокола за развитие
Резюме
Зебрата (Taeniopygia guttata) се превръща във все по-важен модел на организъм в много области на изследване, включително токсикология 1, 2, 3 поведение и памет и обучение 4,5,6. Като единствената пойни птица с секвениран геном, зебрата има голям потенциал за използване в изследвания за развитие; Ранните етапи на развитие на зебрата обаче не са добре проучени. Липсата на изследвания в развитието на зебрата може да се дължи на трудността при дисекция на малкото яйце и ембриона. Следващият метод на дисекция минимизира увреждането на ембрионалната тъкан, позволявайки изследване на морфологията и генната експресия на всички етапи от ембрионалното развитие. Това дава възможност както на ярко поле, така и на флуоресцентно качество на изображения на ембриони, тяхното използване в молекулярни процедури като in situ хибридизация (ISH), анализи на клетъчна пролиферация и екстракция на РНК за количествени анализи като REA. Количествено време-PCR (qtRT-PCR ). Тази техника позволява на изследователите да изучават ранните етапи на развитие, които преди са били трудно достъпни.
Въведение
Общата цел на тази техника е да се получат ембриони на зебра (Taeniopygia guttata) от ранните етапи на ембриогенезата за използване в широк спектър от изследвания за развитие. Зебрата се превърна в преобладаващ модел на птичи птици и се използва широко в различни области, включително токсикология 1,2, поведение 3, памет и обучение 4,5,6, сравнителна невроанатомия 7,8 и езиково развитие от 9.10. Като единствената птица птица с секвениран геном, зебрата позволява генетично и молекулярно изследване на реда Passeriformes, което представлява повече от 50% от известните видове птици 11, 12,13.
Въпреки използването на възрастни и млади зебра чинки в широк спектър от области, са проведени малко проучвания върху ембриони на зебра чинки, особено по време на ранните етапи на развитие. Това може да се отдаде на малкия размер на яйцата и ембрионите, както и на по-скорошния му статут на 14,15,16 моделен организъм за проучвания, при които пилето (Gallus gallus domesticus) преди е било използвано като 17.18.19.20 .21 преобладаваща моделна система. Въпреки това, като негласни ученици, пилетата не са подходяща моделна система за изучаване на генетичната основа на вокалното обучение, развитието на гласово обучение, наследствеността, поведението и базовите ганглийно-кортикални вериги, участващи в обучението. Двигател 10.
Важно е да се отбележи, че ембрионите на зебрата са много по-деликатни и по-лесни за увреждане от пилешките ембриони по време на дисекция и молекулярни процедури. По-специално се изисква по-голямо внимание при извършване на етапите на проникване в ембрионите на зебра. Силните детергенти и ензими, които не биха навредили на пилешки ембрион, могат да навредят на ембрионите на зебрата. От гледна точка на общите грижи, е необходимо яйцата на зебрата да се снасят в малки чашки, преди да се поставят в инкубатор, за да се предотврати счупването им при валцуване по време на инкубацията.
Зебрата чинки са податливи на поведенчески изследвания, лесно и плодотворно се възпроизвеждат през цялата година в плен и са ученици с глас. Тези характеристики позволяват използването на зебрата да отговори на необходимостта от моделен организъм, който интегрира аспектите на езика в развитието, генетиката и поведението. Методите за дисекции, описани по-долу, заедно с наскоро разработеното ръководство за поставяне на специфични за зебра чинки, превръщат зебрата във все по-полезен стандартизиран модел за развитие на организма. Получаването на ембриони в ранните етапи може да бъде обезсърчително. Този протокол позволява на изследователите лесно да получат ембриони в ранен стадий. Проучванията, изследващи ранното развитие и основите на молекулярното развитие на сложното поведение в зебрата, или токсикологичните ефекти върху развитието на други малки, птици-птици, ще намерят тази методология за дисекция полезна.
Протокол
Декларация за етика: Методите са проведени върху опитомени зебри от размножителната колония в колежа на Уилям и Мери. Всички процедури следваха насоките на RSPCA 23 и бяха одобрени от Колежа на Уилям и Мери OLAW (Служба за лабораторни грижи за животните) Осигуряване на хуманно отношение към животните (# A3713-01) и получиха одобрение от институционалната комисия за грижи и употреба на животните (IACUC) (# 2013-06 -02-8721-dacris).
1. Събиране на яйца и инкубация
2. Отстраняването на ембриона от яйцето
3. Отделяне на ембриони от извън ембрионална тъкан
4. Анализ на EdU клетъчна пролиферация. Включване и откриване на EdU в ембрионите на Zebra Finch.
5. EdU "щракнете" Протокол за реакция
Следващите стъпки се извършват върху стъклени флакони.
Представителни резултати
Преди дисекция EdU се инжектира в яйце на 2-ри ден и се оставя да се инкубира през нощта. След дисекция и фиксиране на 16 22 стадийния ембрион, EdU е визуализиран с помощта на "click" химия, позволяваща откриването на пролифериращи клетки, както се вижда в Фигура 6 (A, B, C). Важно е внимателно да се следят точките от времето, когато се поставят яйца в инкубатора и по време на дисекции, тъй като излагането на метилживак или извършването на анализ на EdU може да прекъсне напредъка в развитието. Инжектирането е направено рано на ден 0, който е денят на прибиране на реколтата, както е посочено в стъпка 1.3. Този ембрион е дисектиран приблизително 38 часа по-късно (етап 7-22). Установено е, че процентът на преживяемост е приблизително 90% (същата скорост като контролните ембриони), стига инжекционното количество да е под 478 nl.
Тази методология също така позволява дисекция за извличане на висококачествена РНК. След дисекция на ембриони от етап 16 22 беше извършена екстракция на РНК съгласно протокола на производителя, без да е необходима оптимизация, както се вижда в Фигура 7. Отстраняването на жълтъчната мембрана не беше необходимо за екстракция на РНК и последващи приложения на QRT-PCR.