B-myb набира lin-9 комплекс за активиране на g2m генна транскрипция в карциномни клетки

b-myb

  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Изчерпването на Lin-9 в клетки от миши ембрионален карцином разкрива митотичен дефект
  • Lin-9 е необходим за транскрипция на G 2/M ген
  • Lin-9 се свързва с B-Myb, но не и с джобни протеини в F9 клетки
  • F9 клетките съдържат LINC-подобен комплекс, съдържащ B-Myb и Lin-9
  • Lin-9 и B-Myb се свързват и активират промоторите на G 2/M гените
  • Специфичните места за свързване на промотора Survivin са от съществено значение за свързването на Lin-9 и B-Myb
  • Дискусия
  • Конфликт на интереси
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнителна фигура S1
  • Допълнителна фигура S2
  • Допълнителна фигура S3
  • Word документи
  • Допълнителни фигури Легенда
  • Допълнителни материали и методи
  • Excel файлове
  • Допълнителна информация

Обобщение

Въведение

В това проучване ние изследвахме взаимодействието Lin-9/B-Myb в клетки от миши ембрионален карцином (СЕ) на мишки F9, които за разлика от клетките, изследвани по-рано, се регулират само при прехода G 2/M. В клетките F9 Както при миши ембрионални стволови клетки (ES) (White et al., 2005), Rb, p107 и p130 джобните протеини се поддържат в хиперфосфорилирано състояние. Следователно, няма репресивни комплекси E2F и липса на регулация на клетъчния цикъл в G 1/S. Ние показваме, че потискането на експресията на Lin-9 чрез интерференция с РНК причинява арест в митоза и ние използваме тази система за откриване на Lin-9 транскрипционни цели . По-късно беше показано, че Lin-9 и B-Myb си сътрудничат като транскрипционни активатори на ключови G2/M гени. И накрая, идентифицирахме комплекс B-Myb в клетки F9, който съдържа повечето от компонентите, идентифицирани преди това в LINC. Показателно е, че недиференцирана връзка между джобните протеини и LINC не е открита в недиференцирани F9 клетки, което показва, че клетъчният цикъл се регулира от комплекс B-Myb/LINC само в прехода G 2/M.

Резултати

Изчерпването на Lin-9 в клетки от миши ембрионален карцином разкрива митотичен дефект

Lin-9 се изчерпва от F9 клетки чрез трансфекция на pSuper вектори, кодиращи къса шпилка РНК (shRNA), насочена срещу миша Lin-9. Контролните клетки бяха трансфектирани с pSuper, експресиращ луцифераза shRNA pGL3. Количествената PCR (qPCR) демонстрира, че Lin-9 shRNA значително намалява експресията на Lin-9 със 71% (P

Изчерпването на Lin-9 в клетки от ембрионален карцином на F9 разкрива митотичен дефект. ( да се ) Количествен RT-PCR анализ на експресията на Lin-9 в изчерпани Lin-9 клетки спрямо контролните клетки. Експресията се нормализира до рибозомния ARPP0. ( б ) Western blot анализ на Lin-9, B-Myb и Cyclin B1 в F9 клетки, трансфектирани с shRNA GL3 (контрол), shRNA Lin-9 (Lin-9) и shRNA Lin-9 с резистентни към shRNA pCAGGS-Lin - 9R вектор (спасяване). За контрол на натоварването се използва control-актин. ( ° С ) Проточен цитометричен анализ (FACS) на клетки, изчерпани от Lin-9, контрол и спасяване, оцветени с пропидиев йодид (PI). Стрелката показва клетки с 8n съдържание на ДНК. ( д ) FACS анализ на изчерпани Lin-9 спасителни и контролни клетки, оцветени с антихистон H3 (фосфо S10) -FITC и оцветени с PI. Клетките в митоза се поставят в кутия и митотичният индекс се показва като процент от клетките. Стрелката показва клетки, съдържащи 8n ДНК, подложени на митоза.

Изображение в пълен размер

За да се определи дали изчерпаните с Lin-9 клетки се натрупват в G 2 или митоза, клетките се анализират чрез FACS и конфокална микроскопия. За определяне на митотичния индекс се извършва FACS с клетки, оцветени с антитяло към хистон Н3 фосфосерин 10 (Н3 фосфоС10), маркер на митоза (Paulson and Taylor, 1982). Изчерпаните Lin-9 клетки показаха повишена митотична скорост (16,21%) в сравнение с контролните клетки (3,59%) и спасителните клетки (3,10%; Фигура 1г). Допълнителна популация от клетки, съдържащи 8n ДНК, се наблюдава при изчерпване на Lin-9 и тези клетки се оцветяват положително за H3 phosphoS10, което показва, че те са в митоза. Конфокалната микроскопия на клетки, оцветени с β-тубулиново антитяло и DAPI, показва по-висок митотичен индекс (14,42%) в клетки с изчерпване на Lin-9 в сравнение с контролни (3,38%) и спасителни (3,07%) клетки; Допълнителна фигура S2). Изчерпаните клетки на Lin-9 съдържат уникални ядра и образуват биполярно вретено по време на митоза, което показва, че натрупването на 4n и 8n клетки се дължи на неуспех на митозата, а не на неправилно образуване на вретено или неуспех на цитокинезата.

Lin-9 е необходим за транскрипция на G 2/M ген

Lin-9 е необходим за регулиране на G 2/M гени в ембрионални стволови клетки. ( да се ) Таблица на G 2/M гени, регулирани надолу в изчерпани Lin-9 F9 ембрионални клетки, както е определено чрез cDNA анализ на микрочипове. Експресионните нива на Lin-9 бяха намалени в изчерпани F9 клетки на Lin-9. ( б ) Количествен RT-PCR анализ на Lin-9 целеви гени в изчерпани Lin-9 клетки спрямо контролни клетки за проверка на данни от микрочипове. Изразът се нормализира на ARRP0 .