5 трика, за да бъдеш експерт в Western Blot Labclinics

трика

Молекулярна биология, Протеини

Пет практически трика, за да бъдеш експерт в Western Blot

Western blot (WB) все още е най-широко използваният метод за разделяне и откриване на протеини днес и въпреки това все още е досадно да се налага да се прецизира всеки експеримент. Оптимизирането на нашия експеримент е от решаващо значение и фактори като: качеството на антитялото, блокиращите буфери или ефективността при трансфера са ключови стъпки за успех в процеса.

Ще анализираме подробно какви съвети и инструменти ще ни позволят да подобрим резултатите си.

1. Заредете точното количество протеин

Количеството протеин, което трябва да се зареди във всяка ямка, е променлива и той трябва да бъде оптимизиран от изследователя, тъй като това е фактор, който зависи от нива на изразяване на този ген в тази тъкан. Освен това трябва да се вземе предвид какъв обем на пробата признава тази чаша. Въпреки това, между 10 Y. 50 ug протеин от тъканния хомогенат и между 10 Y. 100 нг общият протеин в пречистени проби обикновено е достатъчен.

2. Трябва ли моите проби да бъдат намалени или денатурирани?

Прегледът на техническия лист с антитела е от съществено значение, за да знаем как трябва да подготвим нашите проби. Обикновено пробите за WB са протеини денатуриран. Нативните протеини имат третична структура и тяхната конформация дава основна роля в функция на протеин. Тази структура обаче ще повлияе на миграция от тези протеини чрез порите полиакриламид. Денатурацията на протеини може да се извърши чрез:

  • Натриев додецил сулфат (SDS), е детергент, използван за разкъсване на водородни връзки и разглобяване на третичната структура.
  • Редуциращи агенти като b-меркаптоетанол или дитиотреитол (DTT) за намаляване на дисулфидните мостове между цистеините.
  • Топлина пробите до 100ºC за денатуриране и улесняване на свързването на SDS.