Техники за пречистване на протеини; Новини-Медицински
Внимание: Тази страница е превод на тази страница първоначално на английски. Моля, обърнете внимание, тъй като преводите се генерират от машини, не че всички преводи ще бъдат перфектни. Този уебсайт и неговите страници са предназначени за четене на английски език. Всички преводи на този уебсайт и неговите уеб страници могат да бъдат неточни и неточни изцяло или частично. Този превод е предоставен за удобство.
Техниките за протеиново инженерство са съществена част от персонализирането или производството на протеини със специфични свойства, които могат да бъдат приложени в различни индустриални процеси. По този начин те са от решаващо значение за биотехнологичните изследвания.
Тези методи обаче разчитат до голяма степен на способността да се изолират и пречистят желаните протеини, за да се разберат техните физични и химични свойства, заедно с техните третични структури и взаимодействия с лиганди и субстрати.
Интензивността, с която се преследва този процес на пречистване, зависи от употребата на протеина. Например, фармацевтичните и хранителните протеини трябва да бъдат доведени до наклон с висока чистота и да преминат през няколко последователни стъпки, уникално възможни, тъй като във всяка стъпка неизбежно ще се загубят някои протеини.
Пречистването на протеиновите молекули е по-просто от пречистването на протеиновите комплекси.
Стъпка 1: Създайте екстракт от суровия протеин
Суровите екстракти от вътреклетъчни протеини се приготвят чрез лизиране на клетката с помощта на химични или механични процеси. След това отломките се отстраняват чрез центрофугиране. Полученият супернатант е далеч от чистата форма, смесен е с много други макро и микромолекули.
Извънклетъчните протеини се получават чрез центрофугиране на разтвора и отстраняване на клетките. Специфичен метод за получаване на суров екстракт от термостабилни ензими е нагряването на сместа, за да денатурира други протеини, и след това да се охлади, за да реформира термостабилните протеини от интерес, като накрая се центрофугира, за да се отстранят денатурираните протеини.
Стъпка 2: междинно пречистване
Осоляване
След това протеините в суров екстракт се пречистват чрез утаяване във силно концентриран солен разтвор, като амониев сулфат. Това работи въз основа на по-ниската разтворимост на протеина при високи концентрации на сол. Всички протеини обаче не се утаяват при една и съща концентрация на сол, което означава, че осоляването помага и за разграждането на протеините. Може да се използва и за концентриране на протеини в разтвор. Тази стъпка увеличава чистотата три пъти и 92% от протеина в разтвора се възстановява.
Диализа
Протеините са големи молекули и това означава, че солите на протеините ще бъдат запазени чрез преминаване на разтвора през полупропусклива мембрана. Целулозата е типична диализна мембрана. Диализата не може да се използва за разделяне на протеини с различно молекулно тегло.
Хроматография
Други техники, използвани за отстраняване на солени протеини, включват хроматография и филтриране с изключване на гел. Те вече се предлагат като готови комплекти за много стандартни протеини и често са подходящи за широкомащабни процеси.
Гел филтрацията работи въз основа на разделянето на размера през колона от порести форми на полимера, като декстран или агароза. Големите молекули могат да протичат само през пролуките между тапицерията, докато по-малките молекули заемат тези пролуки и пространството в тапицерията, намалявайки ги. По този начин елуентът съдържа нововъзникващите молекули в реда на техния размер, от най-големия до най-малкия. Използват се и техники за хроматография с обратна фаза или йонообмен, действащи въз основа на диференцирани хидрофобни свойства и съответно заряд. Обратната хроматография може да бъде ограничена при използването й поради възможна денатурация на протеина от органични разтворители.