Rsk насърчава прехода g2 m чрез активиране на фосфорилирането на cdc25a и cdc25b -

Субекти

Обобщение

Въведение

Подобно на клетки от бозайници, арестувани на мястото на рестрикция на G2, ооцитите на Xenopus (етап VI) естествено спират на границата G2/M на първото мейотично делене и възобновяването на мейотичните клетъчни цикли изисква стимулация и активиране на митогена на каскадата MAPK. При физиологични условия прогестероновата стимулация на напълно израсналите ксенопусни ооцити освобождава ареста на G2 фаза чрез активиране на митотичен Cdk 25, а процесът включва активиране на MAPK каскадата от новосинтезираната MOS протеинкиназа, която от своя страна активира MEK. 26, 27, 28, 29 Поради сходството в свързването на MAPK каскадата с регулирането на G2/M прехода, очертайте молекулярния механизъм, чрез който MAPK каскадата насърчава G2/M прехода в стимулирани осецити на Xenopus с прогестерон. Нови механични прозрения за това как тази каскада регулира положително G2/M прехода в соматични клетъчни цикли.

В това проучване ние характеризираме ролята на RSK във фосфорилирането и активирането на човешки изоформи на Cdc25 (hCdc25) в човешките клетъчни линии. Нашите резултати предоставят доказателство, че RSK играе важна роля във фосфорилирането и активирането на hCdc25A и hCdc25B в процеса на преход G2/M.

Резултати

Рекомбинантни RSK фосфорилират hCdc25 изоформи A, B и C в консервиран мотив близо до каталитичния домен

Сред многобройните потенциални места за фосфорилиране на RSK при xCdc25C, RSK2 предимно фосфорилира S317, T318 и/или S319 при мотива 313 KRRRSTS 319. 36 Сдвоеното подравняване на hCdc25A, hCdc25B и hCdc25C с xCdc25C показа, че местата за фосфорилиране на RSK2 на xCdc25C се намират в запазена област близо до каталитичния домейн (Фигура 1а). В този запазен регион трите hCdc25 изоформи съдържат верига от основни остатъци, които се подравняват с веригата от основни остатъци в xCdc25C. Следвайки основната верига от остатъци, има два остатъка Ser в hCdc25A (S293 и S295), остатък Ser и остатък Thr в hCdc25B (S353 и T355) и остатък Ser в hCdc25C (S247). Тези остатъци Ser/Thr се подравняват с местата за фосфорилиране на RSK2, идентифицирани в xCdc25C (Фигура 1b). Запазването на последователността предполага, че RSK фосфорилира множество изоформи на hCdc25 в този запазен мотив.

cdc25a

Изображение в пълен размер

За да тестваме тази възможност, първо инкубирахме сравними количества GC-маркирани hCdc25A, hCdc25B или hCdc25C (1–2 µg) с конститутивно активен миши RSK (CA-RSK) за 30 минути в присъствието на γ- 32 P-ATP . GST-xCdc25C се използва като положителна контрола. Както е показано на фигура 1в, CA-RSK катализира подобни или по-високи нива на 32 P-включване в GST-hCdc25A, GST-hCdc25B и GST-hCdc25C в сравнение с положителната контрола. След това мутирахме Ser293 и Ser295 в hCdc25A към Ala293/Ala295 (2A), Ser353 и Thr355 в hCdc25B към Ala353/Val355 (AV) и Ser247 в hCdc25C към Ala247 (1A) и определихме ефекта върху CA-RSK-катализатора - фосфизиран. Както е показано на Фигура 1г, тези мутации значително намаляват CA-RSK-медиираното фосфорилиране на hCdc25 изоформите. Заедно тези резултати показват, че пречистеният RSK е способен да фосфорилира запазения мотив и в трите изоформи на hCdc25.

Рекомбинантен RSK и ендогенен RSK в Xenopus яйце екстракти фосфорилират всички предвидени RSK места в hCdc25 изоформи

CA-RSK фосфорилира всички предполагаеми RSK места в hCdc25 изоформи. Обездвижените GST-hCdc25 протеини се подлагат на макет или се фосфорилират с CA-RSK. Протеините, елуирани от измитите мъниста, се имуноблотират с всяко от посочените фосфоспецифични антитела след оцветяване с Ponceau S (Ponc). Контекстът на последователността на фосфорилиращото място, разпознат от всяко от фосфоспецифичните антитела, е посочен по-долу чрез имуноблотинг. ( да се - ° С ) Фосфорилиране на дивия тип (WT) и S293A-S295A (2A) мутантна форма на GST-Cdc25A. ( д Y. и ) Фосфорилиране на мутантната (AV) WT и S353A-T355V форма на GST-Cdc25B. ( F ) Фосфорилиране на WT и S247A (1A) мутантна форма на GST-Cdc25C.

Изображение в пълен размер

RSK сайтовете в hCdc25A и hCdc25B са за предпочитане фосфорилирани в митотични клетки

За да се характеризира RSK-медиирано фосфорилиране на Cdc25 в клетки на бозайници, първо беше определено дали фосфорилирането на RSK места в hCdc25 изоформи е свързано с М-фаза. Човешки ембрионални бъбречни клетки HEK293 (трансформирани) и PC-3mm2 човешки клетки на рак на простатата ( метастатичен) нараства асинхронно (~ 5% клетки при митоза) или се синхронизира при митоза чрез тимидинова блокада, последвана от блок нокодазол (> 80% клетки при митоза). След като денатурираните екстракти на произволни (R) и митохондлично синхронизирани (M) клетки бяха биохимично проверени чрез имуноблотинг с митотичното фосфопротеиново моноклонално антитяло MPM-2 (Фигури 3а и b), фосфорилирането на hCdc25 на местата на RSK с имуноблот. фосфоспецифични антитела. Трябва да имаме предвид, че клетките HEK293 експресират и трите изоформи на hCdc25, докато клетките PC-3mm2 изразяват само откриваеми нива на hCdc25A и hCdc25B (данните не са показани).

RSK местата в hCdc25A и hCdc25B са за предпочитане фосфорилирани в митотични клетки. Протеинови екстракти от HEK293 R и М клетки или PC-3mm2 клетки бяха имуноблотирани с MPM-2 или антиактиново антитяло ( a и b ), с анти-hCdc25A антитяло или A-pS293 антитяло ( c и d ), или с анти-hCdc25B антитяло или B-pS353 антитяло ( и Y. F ). Стрелките показват протеини с пълна дължина, а звездичките показват изместен hCdc25A.

Изображение в пълен размер

За hCdc25A фосфорилирането на S293 беше лесно откриваемо само в екстракти от М клетки (Фигури 3в и d). За разлика от това, нивото на hCdc25A протеин е сходно между R и M екстрактите на PC-3mm2 клетки. Въпреки че нивото на hCdc25A протеин е 2 до 3 пъти по-високо в М, отколкото в R екстрактите от клетки HEK293, тази разлика не може да обясни приблизително 10-кратна разлика в нивото на S293 фосфорилиран hCdc25A. За hCdc25B фосфорилирането на S353 също беше лесно откриваемо само в екстракти от клетъчни клетки М. В този случай нивото на hCdc25B протеин беше сходно между R и M клетъчните екстракти за двете клетъчни линии (Фигури 3д и f). За hCdc25C, S247 фосфорилиране беше открито на гранични нива както в R, така и в M екстракти на клетки HEK293, въпреки наличието на лесно откриваеми нива на hCdc25C протеин (данните не са показани). Тези резултати показват, че RSK местата на hCdc25A и hCdc25B, но не и hCdc25C, са за предпочитане фосфорилирани в митотични клетки.