Неинвазивно изобразяване на дисеминирана кандидоза при протоколи от ларви на риба зебра (преведено на
Обобщение
Бързото развитие на малки размери и прозрачност на зебрата са големи предимства за изследването на вродения имунен контрол на инфекцията 1-4. Тук са ни показани техники за заразяване на ларви на зебра с патогенната гъба Candida albicans Чрез микроинжектиране, методологията, използвана наскоро за включване на активността на фагоцитите на NADPH оксидаза в контрола на диморфизма на гъби 5 .
Резюме
Дисеминираната кандидоза, причинена от патогена Candida albicans, е клинично важен проблем при хоспитализираните лица и е свързана със смъртност от 30–40% 6. Системната кандидоза обикновено се контролира от вродения имунитет и хората с генетични дефекти на вродените имунни клетъчни компоненти като фагоцитна NADPH оксидаза са по-податливи на кандидемия 7-9. Много малко се знае за динамиката на взаимодействието на C. albicans с имунните клетки in vivo. Обширни in vitro проучвания показват, че извън гостоприемника C. albicans покълва в макрофагите и бързо се унищожава от неутрофили 10-14. Проучванията in vitro, макар и полезни, не могат да обобщят комплекса в жизнена среда, което включва зависима от времето динамика на нивата на цитокини, прикачени извънклетъчни матрици и междуклетъчни контакти 10, 15-18. За да се изследва приноса на тези фактори във взаимодействието между гостоприемника и патогена, е от решаващо значение да се намери моделен организъм, който да визуализира тези аспекти на инфекцията неинвазивно при непокътнат жив гостоприемник.
Ларвите на Zebrafish предлагат уникален и многостранен гръбначен гостоприемник за изследване на инфекцията. През първите 30 дни от развитието на ларвите на зебра имат само вродена имунна защита 2, 19-21, което улеснява изучаването на заболявания като дисеминирана кандидоза, които са силно зависими от вродения имунитет. Малкият размер и прозрачност на ларвите на данио позволяват да се изобрази динамиката на инфекцията на клетъчно ниво, както за гостоприемника, така и за патогена. Трансгенните флуоресцентни имунни клетки на ларвите могат да се използват за идентифициране на специфични клетъчни типове, участващи в инфекция 22-24. Модифицираните антисенс олигонуклеотиди (Morpholinos) могат да бъдат използвани за унищожаване на различни имунни компоненти като фагоцитна NADPH оксидаза и изследване на промени в отговор на гъбична инфекция 5. В допълнение към практическите и етични предимства от използването на малък по-нисък гръбначен, рибните ларви Zebra предлага уникална възможност за представяне на разгърнатата битка между патогена и гостоприемника както интравитално, така и в цвят.
Zebrafish се използва за моделиране на инфекция за редица човешки патогенни бактерии и е допринесъл за важен напредък в нашето разбиране за микобактериална инфекция 3, 25. Въпреки това, наскоро много по-големи патогени като гъбички се използват за заразяване на ларви 5, 23, 26 и до момента няма подробно визуално описание на методологията за заразяване. Тук представяме нашите техники за микроинжектиране на заден мозък на заден мозък Prim 25, включително нашите модификации на предишни протоколи. Нашите резултати с модела на ларвите на зебра при гъбична инфекция се различават от проучванията in vitro и засилват необходимостта от изследване на взаимодействието гостоприемник и патоген в сложната машинна среда, а не в опростената система на Петри 5.
Протокол
Всички протоколи и експерименти за грижи за данио са извършени съгласно протокола за институционални грижи и заетост на животните (IACUC) A2009-11-01.
1. Морфолино и инжекционни ястия с ларви
Експериментална продължителност: * (10-15 минути)
Степен на трудност: *
- За инжекции с яйца пригответе 2% разтвор на агароза в стерилна вода и микровълнова фурна. Когато разтворът се охлади, изсипете част от него в допълнително дълбоко блюдо на Петри (Fisher Scientific), докато се напълни наполовина. Охладете се с лед и поставете чинията на нивото.
- След като плаката се охлади, се изсипва отгоре 15 ml слой 2% агароза. Напръскайте оребрена пластмасова форма за инжектиране на яйца (Adaptive Tools of Science) със стерилна вода от спрей бутилка. Внимателно поставете слота надолу в горещата агарозна форма. Когато агарозата се охлади, използвайте плоска метална шпатула (VWR Scientific), за да отделите шаблона от повдигнатия AGA. Постепенно отстранете решетката от агарозата. Увийте емблематичните съдове за инжектиране в Parafilm (VWR Scientific) и ги съхранявайте обърнати при 4 ° C.
- За инжекции с ларви на риби пригответе 2% разтвор на агароза, както е описано. Изсипете разтвора в чаша на Петри със стандартен размер (VWR Scientific) и оставете настрана, докато стане твърда. Увийте плочи с ларви за инжектиране на Parafilm и палатка, обърнати при 4 ° C.
2. Подготовка на гъбната култура
Експериментална продължителност: ** (30 минути)
Степен на трудност: **
3. Инфекции на данио
Експериментална продължителност: **** (1-3 часа)
Степен на трудност: ****
4. Подготовка на рибата в изображението
Експериментална продължителност: ** (30 минути)
Степен на трудност: **
- Пригответе разтвор на трикаин метан сулфонат както преди (200 mg/ml). Извадете заразените риби и ги прехвърлете в Tricaine.
- Пригответе 47,9 ml 0,4% агароза с ниско топене (VWR Scientific) в яйцето и водата. Загрейте разтвора в микровълновата печка. Охлажда се до 37 ° С и се добавя трикаин метан сулфонат (200 mg/ml) към сместа от
- След като рибите бъдат обездвижени в трикаин метан сулфонат, пипетирайте отделни риби в чаша на Петри (VWR Scientific), съдържаща 0,4% ниско топяща се агароза (VWR Scientific).
- След това преместете агарозната риба с ниска стопилка в отделни ямки на стъклена дънна плоча (MatTek Corporation) за изображения. Използвайте възможно най-малко агароза с ниска стопилка, за да могат рибите да лежат на дъното на капсулата. Използвайте само достатъчно количество трикаин-агароза, за да запълните вътрешните кръгове на стъклената дънна плоча.