Недостигът на метионин в храната засяга окислителното състояние, целостта на митохондриите и
Субекти
Обобщение
Въведение
В допълнение към основната си роля като градивен елемент за синтеза на протеини и растежа на животните, метионинът се оказа ключов фактор за контролиране на окислителното състояние 7, 8. Всъщност метиониновите остатъци в протеините лесно реагират с различни реактивни кислородни форми (ROS), за да образуват метионин сулфоксид (MetO), а MetO редуктазите катализират зависимо от тиоредоксин редукция на MetO до метионин in vivo. Следователно това циклично взаимно преобразуване на протеинови метионинови остатъци между окислени и редуцирани форми може да се разглежда като ефективен механизъм за отстраняване на ROS 9, 10. Освен това, метионинът захранва трансулфуризационния път, който води до синтеза на други сярни аминокиселини, по-специално цистеин 11, 12. Цистеинът е необходим за синтеза на глутатион (GSH) и таурин, два компонента, които имат способността да влияят на клетъчното редокс състояние и следователно са от съществено значение за защитата на гостоприемника срещу оксидативен стрес 13, 14, 15, 16 . По този начин метионинът играе ключова роля в защитата срещу оксидативен стрес.
Настоящото проучване е проведено с цел изясняване на ефекта от диетичния дефицит на метионин върху контрола на чернодробното окислително състояние и за идентифициране на основните механизми в дъговата пъстърва (Oncorhynchus mykiss).
Материали и методи
Експериментите са проведени в съответствие с правната рамка на Франция и ЕС. Те спазват директивата 2010/63/ЕС за защита на животните, използвани за научни цели, както и декрет № 2013-118 от 1 февруари 2013 г. на френското законодателство, което регулира етичното отношение към животните. Протоколът е одобрен от Френския национален консултативен комитет по етика под референтен номер APAFIS8222-2017041016141425-v4.
Изпитание за хранене и разплод.
Таблица в пълен размер
Индивидуалната телесна маса, дневният темп на растеж, дневният прием на храна и ефективността на фуражите са изчислени, както е описано по-горе 24 .
В края на 6-седмичното изпитване за хранене, кръв и черен дроб бяха взети от 3 риби на резервоар, обезболени с бензокаин (30 mg/L) и заклани чрез силен удар в главата. Кръвни проби се събират 16 часа след последното хранене на опашната вена в хепаринизирани спринцовки и се центрофугират (3000 g, 5 минути); Възстановената плазма незабавно се замразява и се поддържа при -20 ° C. Черният дроб се събира на 2 h, 4 h и 16 h след последното хранене, дисектира се, претегля се и незабавно се замразява в течен азот и се поддържа при -80 ° C.
Химичен състав на диетите.
DM, суровите мазнини и съдържанието на сурова енергия в диетите се определят, следвайки процедурите, описани по-горе 24. Съдържанието на суров протеин беше измерено като N × 6,25 по метода на Kjeldahl след разграждане на киселина (ISO 937: 1978) и с помощта на анализатора Leco FP-2000 (Leco Corp., St. Joseph, MI). Съдържанието на нишесте се измерва по ензимен метод (InVivo Labs). Концентрациите на аминокиселини в диетата са направени чрез мокра химия в лабораторията Evonik-Degussa (Ханау, Германия) чрез йонообменна хроматография с дериватизация след колона с нинхидрин. Аминокиселините се окисляват с перформатична киселина, която се неутрализира с натриев метабисулфит 25; Директива на Комисията от 1998 г.). Аминокиселините се освобождават от протеина чрез хидролиза с 6N HCl за 24 часа при 110 ° C и се определят количествено с метода на вътрешния стандарт чрез измерване на абсорбцията на реакционните продукти с нинхидрин при 570 nm.
Ниво на плазмен метионин.
Концентрациите на свободен метионин в кръвната плазма се определят чрез йонообменна хроматография с помощта на анализатор на аминокиселини Biochrom 20, литиева колона и литиеви буфери 26, 27 .
Western blot анализ
Чернодробни проби 2 и 16 часа след последното хранене се хомогенизират и анализират съгласно протокол 24, подробно описан по-горе и като се използват следните антитела: антифосфорофозомен протеин S6 киназа 1 (P-RPS6K1, Thr389, # 9205, Cell Signaling Technology); анти-RPS6K1 (# 9202, технология за клетъчна сигнализация); фосфо-EIF4EBP1, белтък, свързващ фактор за иницииране на еукариотния транслация 4E 1 (P-EIF4EBP1, Thr37/Thr46, # 9459, Cell Signaling Technology); анти-EIF4EBP1 (# 9452, технология за клетъчна сигнализация); анти-фосфо eIF2α (Ser51, # 9721, технология за клетъчна сигнализация); антикарбоксилен терминал eIF2α (# 9722, клетъчна сигнална технология); анти-фосфо AMP-активирана протеин киназа (P-AMPK, Thr172, # 2532, Cell Signaling Technology); анти-AMPK (# 2532, технология за клетъчна сигнализация); анти-β-тубулин (TUBB) (# 2146, клетъчна сигнална технология); anti-LC3B (# 2775, Технология за клетъчна сигнализация). Всички тези антитела вече са валидирани в дъгова пъстърва 24, 28 .
За да се оценят нивата на свързани с митохондриите протеини (TIMM23, митофузин2, PARKIN, фосфо-убиквитин (Ser65) и общ убиквитин), тъканите се хомогенизират чрез ултразвуково прекъсване в 9 обем студен буфер, съдържащ 50 mM Tris (рН 7.4). 5 mM EDTA, 1,4-дитиотреитол 2 mM и коктейл с инхибитор на протеаза (Sigma, St. Louis, MO; P-2714). След това хомогенатът се центрофугира и супернатантата се използва незабавно за Western blot анализ, както е описано по-горе и използвайки подходящите антитела: anti-TIMM23 (# 611222, BD Transduction Laboratories ™), анти-митофузин2 (Mfn2) (# ab56889, abcam), анти -PARKIN (# ab15954, abcam), анти-фосфо-убиквитин (Ser65) (Ser65, # ABS1513-I, EMD Millipore) и анти-общ убиквитин (# MAB1510, EMD Millipore). Преди използването на всяко антитяло, аминокиселинната последователност на целевия протеин се наблюдава в базата данни SIGENAE (//www.sigenae.org), за да се провери запазването на антигенната последователност със съответната последователност на бозайници, осигурявайки добра специфичност на бозайникови антитела, използвани при анализа на пробите.