Микробиологични условия за култивиране на Helicobacter Pylori
Микробиологични условия за отглеждане на Helicobacter pylori
Мартин Алонсо Байона Рохас, Bact., Esp., Msc. (1)
(1) Професор в Медицинския факултет, Група за биомедицински изследвания и приложна генетика (GIBGA). Университет за приложни и екологични науки U.D.C.A. Богота Колумбия. e-mail: [email protected]
Дата на получаване: 09-17-12 Дата на приемане: 16-16-13
Навременна диагностика и култура на Helicobacter pylori От голямо значение е да се изследват характеристиките на неговия растеж, както и да се допринесе за познаването на класическата и молекулярна епидемиология, генетичното разнообразие и податливостта към антибиотици. Повсеместността и значението на този микроорганизъм като патоген в световен мащаб ни принуждава да обмислим и предложим ефективни алтернативи за неговото изолиране и рутинно идентифициране в микробиологичните лаборатории. Този преглед беше насочен към описание на литературата относно условията, необходими за култивирането на този микроорганизъм в лабораторията.
Ключови думи
Helicobacter pylori, микробиология, изолация, микробна култура.
ЗАДЕН ПЛАН
Изчислено е, че H. pylori заразява между 50 и 75% от населението на света. От всеки 10 души, заразени от този микроорганизъм, само един страда от заболяване и девет никога не го развиват. Инфекцията е етиологично свързана с появата на пептични язви, било то стомашни или дванадесетопръстника, и с развитието на специален тип стомашен лимфом, наречен малтом; по същия начин той участва в етиологичната мултикаузална верига за развитие на рак на стомаха (1). Всъщност Световната здравна организация класифицира този патоген като биологичен канцерогенен агент за човека (категория 1), където най-високата честота на инфекции се наблюдава през детството в развиващите се страни и изглежда е свързана с икономическите условия. И неблагоприятните хигиенно-санитарни условия (2, 3). Изглежда, че различните щамове са свързани с разнообразието в тяхната вирулентност и взаимодействието на фактори, включително етнически произход, лоша диета, пренаселеност, география и възраст (4).
Тази статия представя преглед на микробиологичните аспекти, ориентирани към културите, и факторите, заложени в нея. За библиографското търсене бяха проучени следните бази данни: Medline, Proquest, Embase, Jstore, Pubmed, Hinary, Springer, Nature, Science онлайн и Oxford Journal и в частни списания като Plos, Nas и Imbiomed. Термините бяха комбинирани: Хеликобактер и поддръжка, добавки за Хеликобактер, Лабораторно поддържане, култура върху твърда среда, чувствителност към антибиотици.
В Колумбия в проучване, проведено от Universidad del Valle във финансиране с Колумбийския институт за развитие на науката и технологиите, те съобщават за разпространение на 69,1% от инфекцията от H. pylori в регионални болници на 16 департамента на Колумбия при биопсични проби, взети от ендоскопия на горния храносмилателен тракт. През предишните десетилетия изследванията върху причините за киселинната пептична болест и стомашния аденокарцином се фокусираха основно върху диетичните фактори, но откриването H. pylori като чест стомашен патоген е променил етиологичните концепции за тези и други гастродуоденални заболявания (5).
Изследването на H. pylori У нас започна в края на предходното десетилетие и има малко доклади на лаборатории с опит в микробиологичните умения, необходими за неговото изолиране и отглеждане (6).
МИКРОБИОЛОГИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Членове на рода Хеликобактер са описани през 1989 г., те колонизират стомаха и червата на хората и някои видове животни, това е извит, микроаерофилен грамотрицателен бацил, има външна мембрана и 4 до 8 полярни бичури, защитени от липидна структурна обвивка. Сред ензимите, които той произвежда, са: уреаза, каталаза и цитохром оксидаза. Уреазата е сред бактериалните фактори на вирулентност на H. pylori който превръща уреята в NH3 и вода, като по този начин алкализира околната киселинна среда; други фактори са представени в липаза, адхезини, каталаза, активиращ фактор на тромбоцитите, протеин на свързания с цитотоксин ген Cag A, pic B (който индуцира цитокини) и вакуолизиращ цитозин Vac A (3, 7).
За култура се вземат проби от стомашна лигавица и екстрагастрални проби, взети от зъбна плака, ректум, пикочен мехур и хранопровод; времето, необходимо за образуване на колонии, се получава между 4 до 7 дни при условия на: 5-10% 02; 5-10% С02; 80-90% N2, влажност 95% и температура от 35 до 37 ° C. Обикновено се отглежда в сложна среда с кръв, серум и антибиотици (7).
УСЛОВИЯ ЗА ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ
Препоръчителният протокол за вземане на биопсии при пациенти с хроничен гастрит е този, предложен от системата в Сидни. трябва да бъде отбелязано че H. pylori Намира се предимно в антралната част на стомаха, с изключение на лица, лекувани с ИПП и анти-Н2 антихистамини, където в тялото се откриват по-високи плътности. Трябва да се вземат 5 биопсии, както следва: две антрални проби от по-голямата и по-малката кривина на 2 до 3 сантиметра близо до пилора, две проби от тялото от по-голямата и по-малката кривина на 8 сантиметра дистално от кардията и проба, започваща от incisura angularis (8). Използвайки този протокол, бактериите могат да бъдат открити на практика при всички заразени индивиди (9). Взимането на биопсия е практически безболезнен процес за пациента, но това е процедура, която трябва да се извърши от експерт гастроентеролог, следвайки установени протоколи за медицинска етика. Процедурата не се препоръчва за пациенти с кървящи язви, тъй като може да представлява опасност от кървене. Всички изследвания трябва да бъдат одобрени от Комитета по етика и да имат ясно информирано съгласие.
Използвани са и други стомашни проби, като стомашен сок, получени чрез теста на струните ("тест на струни") и изолиране от повръщане, което дава различни резултати. H. pylori Понякога се култивира и от екстрагастриални проби като зъбна плака, хранопровод, ректум и пикочен мехур.
Аспекти, които трябва да се вземат предвид: ако пациентът е бил на антибиотици, е необходимо да се изчакат поне четири седмици след последната доза, за да се получат задоволителни резултати по отношение на културата. Форцепсът, с който се извършват биопсиите, трябва да бъде адекватно дезинфекциран, за да се избегне замърсяване между пациентите; ако дезинфекцията е твърде силна, това може да повлияе на жизнеспособността на бактериите.
Пробите за биопсия трябва да се смилат или пулверизират с малко количество физиологичен разтвор, преди да се приложат върху средата. Хомогенната проба трябва да се постави незабавно на повърхността на средата: тя трябва да се вземе с дръжка и след това да се разстила по повърхността с метод за разпръскване за изолиране (8, 9).
Получените проби трябва да бъдат обработени бързо, тъй като микроорганизмът е много чувствителен към околната среда. Пробите за биопсия (взети от антрума и от тялото) трябва да се поставят в стерилна епруветка с винтова капачка с 0,5 ml физиологичен разтвор и да останат там най-много 6 часа. Ако се очаква закъснение, трябва да се използват транспортни средства като среда на Стюарт и да се съхраняват при температура от 4 до 8 ° C за не повече от 24 часа преди обработката, след което се хомогенизират и засяват в два екземпляра в различни културни среди, включително бульон и агар Бруцела, BHI, Mueller Hinton, алумин от Колумбия и триптиказа от соя обикновено се допълват с фетален говежди серум, еритроцитен лизат, дрожден екстракт, пептон и цианобактериален екстракт. Кръв (кон, агнешко, заешко) обикновено се добавя между 7 и 10%, а сред антибиотиците, които се добавят към средата, са: ванкомицин, сулфаметоксазол, триметоприм, цефсулодин и полимиксин В. Пробите могат да се съхраняват в соев бульон от триптиказа или добавен BHI с 20% глицерол, които се съхраняват във фризер при -80 ° C или течен N2 (10-12).