Кристална структура на многодоменен човешки изгладен рецептор в комплекс със суперлиганд

структура

  • Субекти
  • Обобщение
  • Въведение
  • Резултати
  • Рационален дизайн на нов лиганд за структурни изследвания.
  • Обща архитектура на многодоменния човешки SMO
  • Уникално многодоменно взаимодействие
  • Сравнение на човешки SMO ​​с други рецептори от клас на къдрене
  • Дискусия
  • Методи
  • Синтез на TC114
  • Конструкция на термоядрен синтез SMO-FLA, предназначена за структурни изследвания
  • Експресия и пречистване на сливания протеин SMO-FLA
  • Кристализация в LCP за събиране на синхротронни данни
  • Събиране на синхротронни данни и определяне на структурата
  • Кристализация в LCP за събиране на данни XFEL
  • Събиране на данни от XFEL и определяне на структурата
  • Анализ на мас-спектрометрия за обмен на водород-дейтерий
  • MD симулация
  • Приготвяне на протеини и изграждане на системата.
  • Молекулярна динамична симулация и анализ на данни.
  • Тест за сигнализация на таралеж
  • Анализ на Western Blot
  • Наличност на данни
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Файл за партньорска проверка
  • Коментари

Субекти

  • Биология на развитието
  • Нанокристалография

Обобщение

Изгладеният рецептор (SMO) принадлежи към клас Frizzled на суперсемейството на G-протеин-свързан рецептор (GPCR), съставлявайки ключов компонент на сигналния път на таралежа. Тук представяме кристалната структура на многодоменен човешки SMO, свързан и стабилизиран от инструмент, проектиран от лиганд TC114, използващ източник на рентгенов лъч без електронни лъчи 2,9 Å. Структурата разкрива прецизно подреждане на три различни домена: седем трансмембранен спирален домен (TMD), шарнирен домен (HD) и непокътнат богат на извънклетъчен цистеин домен (CRD). Тази архитектура позволява алостерични взаимодействия между домейните, които са важни за разпознаването на лиганда и активирането на рецептора. Чрез комбиниране на структурни данни, симулация на молекулярна динамика и анализ на обмен на водород-дейтерий, ние демонстрираме, че трансмембранната спирала VI, извънклетъчната верига 3 и HD играят централна роля в предаването на сигнала с помощта на механизъм за активиране. GPCR.

Въведение

Резултати

Рационален дизайн на нов лиганд за структурни изследвания.

Пресеченият SMD на CRD (ΔCRD-SMO) преди това е съкристализиран с няколко малки молекули, включително антагонисти и агонисти 3, 8, 9. Тези лиганди и други не произвеждат кристали на мултидомен SMO, които съдържат непокътната CRD без стабилизиращи мутации. Анализът на по-ранни структури на ΔCRD-SMO 3, 8, 9 предполага, че кристализацията на мултидомен SMO може да изисква стабилизиране на някои специфични гъвкави части на структурата. Например установихме, че K395, разположен в горната част на β фиби в извънклетъчната верига 2, може да участва във взаимодействия със съседни остатъци или лиганди 3 и следователно вероятно приема динамично конформационно състояние (фиг. 1а). Следователно, ние предполагаме, че по-нататъшното стабилизиране на този регион чрез установяване на определено и по-силно взаимодействие може да намали конформационната хетерогенност.

( да се ) Изглед отблизо на джоба за подвързване LY2940680 в структура ΔCRD - SMO (PBD ID: 4JKV). ( б ) Проектиране и развитие на аналози LY2940680 за изследване на кристализацията чрез вариация на заместителите на ароматния пръстен. ( ° С ) Представителни стойности на Tm за LY2940680 и неговите аналози съгласно теста за топлообмен CPM. ( д ) Изглед отблизо на джоба за подвързване TC114. TC114 (оранжеви въглероди) и SMO ​​остатъци (цианови въглеродни атоми), участващи в свързването на лиганда, са показани в лентово представяне. Приемникът е показан в светлосиньо анимационно изображение. Други елементи са оцветени, както следва: кислород, червено; азот, тъмно синьо; сяра, жълто. Водородните връзки са показани като пунктирани пурпурни линии.

Изображение в пълен размер

Анализът на нашите многодоменни SMO ​​структури показва, че нитро групата, въведена в лиганда TC114, силно взаимодейства с K395 в SMO, както е проектирано, и подобрява подреждането π - π между бензоилната група и F484 в спирала VI (фиг. 1г). Следователно заключаваме, че TC114 стабилизира мултидомен SMO, като поддържа VI спиралата в стабилна конформация, което от своя страна засилва хидрофобното взаимодействие между разширения ECL3 и хидрофобния CRD жлеб. Следователно, проектираният лиганд TC114 постигна желаната цел, действайки като супер стабилизиращ агент в теста за термична стабилност и позволявайки изследването на мултидомен SMO кокристализация.

Обща архитектура на многодоменния човешки SMO

Общата структура на SMO (фиг. 2а; допълнителна фиг. 4) споделя GPCR 7 ™ канонична гънка с амфипатична спирала VIII, която минава успоредно на равнината на мембраната. CRD седи изправен върху TMD и се поддържа от извънклетъчен контур 3 (ECL3) от едната страна и от свързващ контур (остатъци 181–190) от другата. CRD и TMD са свързани чрез HD (остатъци 191–220). Освен това, от извънклетъчната страна на конструкцията (фиг. 2б), спиралата VI се простира отвъд повърхността на мембраната в четири α-спирални завои, а върхът на спиралата VI се спуска в непролинен завой към CRD, изпъквайки в неговата хидрофобна бразда и свързване на ключова връзка между CRD и TMD. CRD (остатъци V107, L108, L112), HD (остатък V210) и ECL3 (остатъци V494, I496) образуват хидрофобен джоб (фиг. 2в). По-рано беше съобщено, че този джоб представлява място за свързване на оксистерол 7, 19 .

( да се ) Глобална структура на човешки SMO ​​в комплекс с TC114, определена в XFEL. TC114 е показан като оранжеви пръчици. CRD, Linker, HD и TMD са посочени като карикатура съответно оранжево, морско, цианово зелено и светло синьо. Границата на мембраната е обозначена като оранжева пунктирана линия. N-свързаните гликани (NAGs) са показани в зелени ленти. ( б ) Изглед отгоре на SMO от извънклетъчната страна. Хидрофобният джоб се формира от хидрофобния CRD жлеб и ECL3 (морска дръжка). ( ° С ) Ключовите остатъци в CRD и ECL3, които определят хидрофобния джоб, са показани съответно в циан и светлосини ленти, съответно.

Изображение в пълен размер

Уникално многодоменно взаимодействие

Изображение в пълен размер

Сравнение на човешки SMO ​​с други рецептори от клас на къдрене

( да се ) Страничен изглед на структури, насложени върху човешки CRD SMO (hSMO) с CRD hFzd-4 (PDB ID: 5CL1) и mFzd-8 (PDB ID: 4F0A). SMO, hFzd-4 и mFzd-8 са показани като карикатури, съответно в светло синьо, лимонено зелено и оранжево. Wnt и Norrin са показани съответно като тъмносиви и оранжево-жълти карикатури. Палмитоиловата група в mFzd-8 CRD е показана в морски сфери. ( б ) Място 1: Изглед отблизо на палмитоиловата група с взаимодействащи остатъци като портокалови пръчици. Палмитоиловата група е показана в морски пръчки. Остатъците от SMO, които съставляват хидрофобния джоб, са показани в светлосини ленти, mFzd-8 в оранжеви ленти. ( ° С ) Обект 2: Повърхност на SMO и hFzd-4 CRD. Норин е показан в светлооранжев анимационен филм. Цветовият градиент от светлочервен до тъмночервен съответства на промяната на свойствата на повърхността от хидрофилна към хидрофобна. Мястото за свързване на Norrin на повърхността на hFzd-4 CRD е маркирано с черен пунктиран кръг със съответното място, маркирано също на SMO повърхността.