Ефект на връзката ензим-субстрат върху ензимната хидролиза на говежди суроватка от Alcalasa®

Ефект на връзката ензим-субстрат върху ензимната хидролиза на говежди суроватка от Alcalasa® 2.4L

Омар А. Фигероа 1

Санди П. Пенялоза 2

1 Инженерен факултет, Департамент по агроиндустриално инженерство, Универсидад де ла Гуахира, Km 5 Via Maicao, Риохача, Колумбия. (имейл: [email protected])

2 Инженерен факултет, Катедра по агроиндустриално инженерство, Универ. Популярен дел Цезар, Диагонал 21 № 29-56 Валедупар-Колумбия. (имейл: [email protected]; [email protected])

3 Факултет по фармацевтични и хранителни науки, катедра „Хранителни продукти“, Университет Антиокия, Calle 70 # 52-21, Apartado Aéro 1226, Меделин, Колумбия. (имейл: [email protected])

Целта на това проучване беше да се анализира антиоксидантният капацитет (измерен с FRAP и ABTS) и потенциалът за хелатиране на желязо във времето при различни ензимни и субстратни условия. Ензимната хидролиза на прахообразна говежди суроватка се провежда в реактор за периодична употреба с капацитет 0,5 L и постоянна температура. Хидролизатите с най-висока активност се разделят според техния молекулен размер при съотношение> 100, 10-100, + е ниско. Увеличението на степента на хидролиза благоприятства антиоксидантната активност, измерена по метода ABTS, както и хелатиращата активност на желязото на хидролизатите.

Ключови думи: ензимна хидролиза; суроватка; алкалаза; протеини; антиоксидантни пептиди

Основната цел на това проучване беше да се анализира антиоксидантният капацитет (измерен с FRAP и ABTS) и хелатиращият потенциал на желязото във времето при различни ензимни и субстратни условия. Ензимната хидролиза на говежди суроватъчен прах се провежда в реактор за периодична употреба с капацитет 0,5 L и постоянна температура. Най-активните хидролизати се разделят според техния молекулен размер при скорост> 100, 10-100, + катионите са ниски при ниски субстрати. Увеличението на степента на хидролиза благоприятства антиоксидантната активност, измерена по метода ABTS и хелатиращата активност на хидролизираните метали.

Ключови думи: ензимна хидролиза; суроватъчни протеини; алкалаза; протеини; антиоксидантни пептиди

Различни изследвания установяват връзката между биологичната активност на пептидите и тяхното молекулно тегло. По-специално, пептидните фракции с молекулно тегло между 1 - 4kDa, биха били най-интересни за хранителни и/или фармацевтични цели (Saidi et al., 2014). Както ултра, така и нанофилтрацията са технологии, използвани с относителен успех за пречистване на пептиди с биоактивни ефекти от хидролизирани млечни протеини, соя и растителни субстрати (De Castro and Sato, 2015). Реакцията на ензимна протеинова хидролиза има голяма сложност главно поради: i) разнообразния и често неизвестен характер на субстратите (първични и третични структури на различни протеини), ii) образуването на нови хидролизни субстрати с напредването на реакцията, iii) освобождаване на къси пептиди и свободни аминокиселини, причиняващи сериозни инхибиции. iv) инактивиране на ензима във времето (Valencia et al., 2015) и v) ефекти, свързани с различната реактивност на връзките по отношение на използвания ензим, както и тяхната достъпност до специфични места за реакция (третична структура и кватернер на протеини) (Fernández и Riera, 2013).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

След това са описани елементи, свързани с управлението на реакционните системи, използваните аналитични методи и дизайна на използваните експерименти.

Система за реакция

Хидролизата се извършва в стъклен реактор с капацитет 0,5 L, с водна циркулационна риза за регулиране на температурата, свързана с циркулационна баня с термостатичен регулатор MX07R-20 (Thomas Scientific, САЩ ± 0,07 ° C). За контрол на рН и записване на температурата на реакцията е използван комбиниран стъклен електрод с неподвижна заземена мембрана, свързан към автоматичен титратор Titrando 842 (Metrohm, Швейцария), управляван от компютър (софтуер Tiamo 1.2.1), както е показано на фиг. 1. Реакционната среда непрекъснато се разбърква с помощта на магнитна бъркалка 801 (Metrohm, Швейцария) със скорост 400 rpm. Температурата и pH в системата се поддържат постоянни със стойности съответно 61 ° C и 9.

Използвана е пулверизирана суроватка от говеждо мляко, придобита от търговски доставчик в град Богота-Колумбия, с декларирано съдържание на протеин от 12%. Тези данни бяха потвърдени от метода на Kjeldahl (AOAC 2005, 954.01), като се използва 6.38 като конверсионен фактор за оценка на съдържанието на протеин. Ензимът съответства на ендопротеаза от Bacillus licheniformis от търговския препарат Alcalasa ® 2,4 L (2,4 AU-A/g) хранителен клас (Novozymes, Дания).

Фиг. 1. Схема на реакционната система на хидролиза, използвана в експеримента.

Процес на ензимна хидролиза

Реакцията беше проведена с помощта на ензимна хидролиза, контролирана с метода pH-stat, признат за най-използвания в ензимната хидролиза поради своята простота (Rutherfurd, 2010), която се състои в поддържане на рН постоянно чрез добавяне на основа или разредена киселина. За този случай, тъй като става въпрос за алкална реакция, беше използван 1 M NaOH.По принцип добавената основа за поддържане на постоянното рН неутрализира само протоните, отделени по време на разграждането на амидната връзка на протеини и пептиди при алкално рН, се заменят с катиона на основата; по този начин протоните, генерирани от хидролиза, са еквивалентни на молите на добавената основа (Adler-Nissen, 1986). Оценката на GH е направена с помощта на уравнение.

Където: h = Брой хидролизирани пептидни връзки; Htot = Общ брой пептидни връзки в протеиновия субстрат (екв/кг); VNaOH = обем на общия NaOH (L), Nb = нормалност на основата, Mp = маса на протеина (в kg), GH = степен на хидролиза.

Степента на дисоциация на α-NH2 групите, освободени в реакцията, α, се изчислява директно от уравнение (2) и зависи от работното рН и рК. Последното варира значително в зависимост от реакционната температура и може да бъде оценено съгласно уравнение (3) (Salazar et al., 2012). Използва се изчислено α от 0,992 и htot от 8,8 meq/g, което е съобщено за суроватъчните протеини (Adler-Nissen, 1986).

Където: α = степен на дисоциация на протеина и T = работна температура в градуси по Келвин.

Описание на дизайна

В анализа се проверява влиянието на E0 (150, 300 и 600 mg/L) и S0 (5.10, 10.20 и 20.40 g/L) през реакционното време (0-120 min) върху антиоксидантния капацитет in vitro (ABTS и FRAP) и хелатиращата способност на желязото (CQFe). Сравнителен анализ на еволюцията на различните зависими променливи беше извършен в две групи експерименти: A) вариращ S0 и поддържащ E0 постоянен; Б) поддържане на S0 постоянно и вариращо E0, както е посочено в таблица 1. Нивата на концентрацията на субстрата съвпадат с района, близък до стойността на Km, където началната скорост на хидролиза е значителна, в кривата на насищане. Докато използваните нива на ензими бяха определени от предишни непубликувани тестове. В анализа се използва ANOVA за повтарящи се мерки с вътрешно-субективен фактор (време: 0, 10, 20,75 и 120 минути) и между-субективен фактор (S0 или E0 за всеки експеримент), със статистически данни за ниво на значимост от 0,05. Всяка хидролиза при зададените от проекта условия се извършва в три екземпляра.