Валидиране на in vitro модела на хранене с използване на ентерална формула в неутрофили

Кореспонденция на: Д-р М. Фариол.
Център за метаболитни изследвания и молекулярна биология (CIBBIM).
Обща болница Vall d´´Hebron.
Passeig Vall d'Hebron, 119-129.
08035 Барселона. Испания.
Имейл: [email protected]

Получено: 21.9.2002.
Прието: 30-I-2003.

Въведение

Неутрофилите бързо умират инвитро и да изпитате морфологичните промени, типични за клетките, подложени на програмирана клетъчна смърт 1. Културата на неутрофили предполага намаляване на тяхната жизнеспособност в рамките на часове, което ги прави отлични „тестови“ частици за изследвания върху стареенето на клетките. Да се ​​определят ефектите от храненето върху промените, причинени от стареенето на клетките, различни хранителни елементи, като аминокиселини, витамини, растежни фактори, липиди и др. се добавят към стандартни културни среди, обикновено като единични добавки, и се определя тяхната биохимична модулация на метаболитните пътища 2 .

Неспецифичният отговор на неутрофилите към инфекция е сложен. Сред многото замесени фактори е известно, че компонентите на клетъчната среда играят голяма роля. Липидният състав на средата има призната роля в възпалителния отговор, въпреки че няма консенсус относно степента на участие или значението на дължината или наситеността на мастните киселини в този контекст 3. В проучванията по този въпрос липидите се добавят като изолирани добавки на MCT, LCT или смеси от тези мастни киселини 4, 5. Към днешна дата обаче няма информация за метаболитните промени, настъпили в неутрофилните клетъчни култури след добавяне на търговски ентерални диети с липиди и други хранителни вещества.

Целта на това проучване е да потвърди модела на клетъчната култура, подходящ за оценка на ефектите на стандартните хранителни формули върху функцията на неутрофилите инвитро. По-конкретно, ние разработихме модел на остарели клетки, в който се оценява пълна търговска формула, съдържаща единствено LCT като липиден компонент и често използвана при гериатрични пациенти.

материали и методи

В предварителния етап ние определихме оптималната продължителност на културата и дозата на диетичната емулсия за целите на изследването чрез изследване на жизнеспособността на клетките и морфологичните промени. След като тези параметри бяха установени, ние изследвахме функционалността на неутрофилите чрез измерване на фагоцитоза, фрагментация на ДНК и липопероксидация. Всички експерименти бяха проведени най-малко три пъти.

Култура на неутрофили

Локва пълна кръв беше събрана след едно нощно гладуване от здрави доброволци на възраст от 18 до 55 години и неутрофилите бяха отделени от цяла кръв с Polymorphrep TM (разтвор на натриев метризоат/декстран, d = 1.113) при 1/2 (v/v) чрез центрофугиране при 1750 rpm в продължение на 30-35 минути при стайна температура. Пробата се промива с равен обем ClNa 0,45% и още два пъти с равни обеми физиологичен разтвор 0,9%. Червените кръвни клетки се лизират чрез смесване на гранулата в 10 ml студен буфер за лизис (155 mM NH 4 Cl; 10 mM KHCO 3; 0.1 mM EDTA; рН 7.4) в продължение на 10 минути. Неутрофилите се центрофугират, промиват се два пъти и се посяват в RPMI-1640 хранителна среда с L-глутамин и FCS 10% без антибиотици. Клетки с или без добавена диетична емулсия се инкубират в продължение на 18, 42 или 76 часа при 37 ° С в атмосфера от 5% CO 2.

Използвахме пълна стандартна ентерална диета (Cubitan; Nutricia Spain), съдържаща 3,5 g липиди на 100 ml, 14,2 g въглехидрати и 10 g протеини. Липидният състав е както следва: 97,1% растително масло (рапица и слънчоглед) и 2,9% млечна мазнина, което води до 98,7% триглицериди с дълга верига (LCT) и 1,3% триглицериди със средна верига (MCT). Моларността се изчислява, като се приема, че молекулното тегло на LCT е 865 далтона, както е описано 4. Използваните липидни концентрации се коригират в съответствие с протокола и са еквивалентни на 0,04, 0,08, 0,2 и 0,4 mM от LCT. В някои експерименти се добавят само по-високите дози от 0,2 и 0,4 mM LCT.

Клетъчна жизнеспособност и морфология

Клетките се оцветяват с Trypan Blue при 0,2% във физиологичен разтвор и се преброяват чрез светлинна микроскопия. Освен това клетките се оцветяват с May-Gr Grnwald/Giemsa и се изследва морфологията (х 100 светлинна микроскопия). За да се определи цитозолното увреждане, ензимната активност на лактодехидрогеназата (LDH) беше измерена в супернатантата чрез автоматизирана техника за спектрометрия, използваща пируват като субстрат и адаптирана към инструмента Hitachi 747.

Фагоцитоза

За това и всички следващи определяния, клетките първо се центрофугират, за да се получат гранули. Количественият NBT тест се провежда върху аликвотни части от 250 µL (2,5 х 105 клетки), смесени с 20 µL фосфатен буфер (PBS; рН 7,4) за нестимулираните проби или с 20 µL суспензия от латексни зърна (диаметър на частиците 1,094 µ, Sigma: LB-11) за стимулираните проби. Към всички проби се добавя 250 µL обем от 0,1% нитроблуй от тетразолий (Sigma: N-6876), разреден във фосфатен буфер (рН = 7,4). След 30 минути инкубация при 37 ° С реакцията се спира, епруветките се центрофугират при 3000 х g в продължение на 30 минути, супернатантите се изхвърлят и редуцираният NBT се екстрахира с диоксан (Sigma). Оптичната плътност (OD) беше измерена в супернатантите при 525 nm, като се използва диоксан като празна контрола, както е описано 6 .

Биохимични маркери