СЪСТОЯНИЕ НА ОКСИДАТИВНИЯ СТРЕС В ЕКСПЕРИМЕНТАЛЕН МАСТЕН ЧЕРЕН ДЪРВЕН МЪЖКИ МИШКИ И ПРОЕКЦИЯТА НА
Източник: Съвет за научно, хуманистично и технологично развитие на Универсидад Centroccidental "Lisandro Alvarado" (UCLA, Венецуела)
Бенефициент: Аура Амирика Лупес-Ортега, Изабел Кристина Мъркес-Алварадо, Алейди Йозефина Арангурен-Пара, Мигел Бнгел Плаза- Кариун и Марна Дивина Мурильо Лупес де Силанес
Ключови думи: Мастен черен дроб, етионин, оксидативен стрес, дисфункция.
Резюме: Във ветеринарната медицина ролята на оксидативния стрес (OS) в животновъдството и репродукцията стана важна поради промяната на двете функции при животни с хепатостеатоза или мастен черен дроб (FL). Това проучване има за цел да определи дали е установено състояние на чернодробна ОС в експерименталния FL, причинен от етионин при възрастни мъжки мишки NMRI и дали чернодробната функция е променена. Използвани са две групи от 10 животни: една контролна и друга, третирани с DL-етионин интраперитонеално при 7,5 mg/20 g телесно тегло. Размерът и характеристиките на FL се определят хистологично и количеството на депата на чернодробните мазнини се определя чрез концентрацията на триглицериди. И двата анализа потвърждават генерирането на хепатостеатоза при мъже, инжектирани с DL-етионин. Продуктите от липопероксидативно разграждане (конюгирани диени (CD) и малондиалдехид (MDA), показатели на клетъчната ОС, са количествено определени спектрофотометрично чрез концентрацията му в чернодробния хомогенат. AST), използвайки търговски комплекти.Индукцията на FL предизвика значително повишаване на CD от 231,18 ± 15,53 µmol/mg протеин до 297,45 ± 23,10 mmol/mg протеин (P
Ключови думи: Мастен черен дроб, етионин, оксидативен стрес, дисфункция.
Оксидативният стрес (OE) участва във възпалителни процеси, както и чернодробни заболявания, отчитат се високи концентрации на реактивни O2 видове (ROS) [18], а произходът на увреждането на черния дроб е свързан със съществуването на свободни радикали (RL), които може да липопероксидира клетъчни компоненти като мембрани и да причини промени, които водят до загуба на клетъчната функция. При NAFLD чернодробната функция е засегната, както е експериментално определено [13]. Настоящото проучване има за цел да установи дали в експерименталния HG, причинен от етионин при лабораторни мишки-албиноси (Mus musculus Linnaeus, 1758) NMRI за възрастни мъже, е установен EO статус в черния дроб, както и да определи количествено възможната промяна във функцията каза органът.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
За това проучване бяха използвани мъжки мишки от популацията на лабораторни мишки албиноси, по-специално от щама NMRI, от Централното животновъдно съоръжение на Университетския Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA), Венецуела. Чрез просто произволно вземане на проби бяха избрани 20 възрастни мъжки мишки със средно телесно тегло 27,5 ± 1,5 грама (g) по скала на Ohaus (Tripe Bean Balance, 700 Series, Florham Park, NJ, USA), поставени в индивидуална неръждаема стомана клетки, при светлинни цикли от 12 часа (час) светлина/12 часа тъмнина в стандартизираните условия на Биотерия на Изследователския отдел по функционални науки "Д-р Хайти Мусач" (UNIHM) Декан на науките UCLA Ветеринарна медицина (DCV). С безплатен достъп до вода и търговски фураж за мишки Ratarina® (Protinal, Венецуела). Изследването е проведено в съответствие с Кодекса за биоетика и биобезопасност на FONACIT-Венецуела [10].
Индукция на безалкохолен HG:
Животните бяха разпределени на случаен принцип в две групи от по 10 животни всяка: контролна група и друга, инжектирана с DL-етионин (Sigma Chemical Co., МО, САЩ), разтворен в стерилен физиологичен разтвор, прилаган i.p. в дози от 7,5 mg/20 g телесно тегло. Контролите се инжектират само с носителя (стерилен физиологичен разтвор). И двете групи бяха подложени на 48-часов пост с безплатен достъп до питейна вода.
Вземане на проби, определяния:
След гладуване в продължение на 48 часа, мишките чрез кокцигеална венепункция се получава кръвна проба, обработена с етилендиамин тетраоцетна киселина (EDTA) -Na 2% антикоагулант. Плазмите се разделят чрез центрофугиране (800 g, 20 4 минути) в хладилна микроцентрифуга Eppendorf 5402 (Brinkman Instr., NY, USA) и се държат в хладилник Mabe RMT, 41XMVEB (Колумбия). След като кръвната проба беше получена, животните бяха евтаназирани под лека анестезия с етер. Черният дроб се дисектира, оценява се макроскопският му вид и се поставя в 250 mM трис-захарозен буфер рН 7,2 при 4 ° С. 1.5 g черен дроб се хомогенизира с 3 пъти теглото му в Tris-захарозен буфер при 4 ° C в NSI-12 Bodine potter (Electric Comp., Chicago, USA). Супернатантът на хомогената, разреден 1:40 с дейонизирана вода, се държи в хладилник до момента, в който са приложени съответните анализи.
Определяне на величината и характеристиките на HG: Малка част от черния дроб, фиксирана в 10% буфериран формалин, е използвана за неговото хистопатологично изследване, проведено в лабораторията по патологична анатомия на ветеринарна болница „Dr. Humberto Ramnrez Daza “от DCV-UCLA. Получени са 4 микронови среза на тъканта с помощта на микротом Jung AG (Хайделберг, Германия) и последващо оцветяване на срезовете с хематоксилин-еозин съгласно конвенционалната техника.
Количество отлагане на чернодробни мазнини: В разредената супернатанта на чернодробния хомогенат концентрацията на триглицериди се определя чрез ензимен метод, използвайки комплект Qualitest (Ind. Qualitest, Каракас, Венецуела). Резултатите са изразени в милиграми (mg) триглицериди/mg протеини, които са определени с помощта на комплекта Pierce (ILL, САЩ) въз основа на техниката на Брадфорд [5].
Количествено определяне на липопероксидативните продукти на разграждане: В супернатантата на чернодробния хомогенат се определя концентрацията на конюгирани диени (DC), чрез техниката, описана от Wallin [22], както и концентрацията на малондиалдехид (MDA) с помощта на TBARS (реактиви с барбитурат 2-тио киселина) съгласно Ohkawa [21].
Определяне на увреждане на чернодробната функция: В плазмата се определя активността на аланин аминотрансфераза (ALT) и аспартат аминотрансфераза (AST), като се използват търговски комплекти (Wiener lab, Rosario, Аржентина). Всички спектрофотометрични показания са извършени на Genesys 5 (NY, САЩ).
Статистически анализ на резултатите: Извършен е с помощта на статистическия софтуер SPSS (Статистически пакет за социални науки или Статистически решения за продукти и услуги) версия 17.0 за Windows. Резултатите са изразени като средна стойност на стойностите ± стандартна грешка. За да се установи статистическата значимост на резултатите, беше използван тестът на t на студента, изискващ 95% сигурност (P РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ
На фиг. 1А показва макроскопичния външен вид на контролния възрастен мъжки NMRI черен дроб на мишка с тъмен оттенък, а на фигура 1В черния дроб на животно, инжектирано с DL-етионин, който има светъл цвят за разлика от контролното животно. Хистологичното изследване на черния дроб на контролни възрастни мъжки NMRI мишки показва чернодробни клетки с нормален външен вид (ФИГ. 1С). Въпреки това, в черния дроб на мишки, лекувани с DL-етионин, се наблюдава умерена метаморфоза на чернодробната мастна тъкан, с големи и малки цитоплазматични вакуоли в хепатоцитите и наличие на мегалоцити и печатни пръстеновидни клетки (ФИГ. 1D).