ИЗСЛЕДВАНЕ НА КОМБИНИРАНА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 КОМБИНИРАНА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 И ОХРАТОКСИН
ИЗСЛЕДВАНЕ НА КОМБИНИРАНАТА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 И ОКРАТОКСИН А В IN VITRO И В VIVO МОДЕЛИ КОМБИНИРАНА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 И ОХРАТОКСИН А В ВИТРО И В ВИВО МОДЕЛИ Laura Ana Corcuera Martínez DOCTORAL
Изследователската работа, озаглавена: ИЗСЛЕДВАНЕ НА КОМБИНИРАНАТА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 И ОКРАТОКСИН А В IN VITRO И В VIVO МОДЕЛИ КОМБИНИРАНА ТОКСИЧНОСТ НА АФЛАТОКСИН В1 И ОХРАТОКСИН А В ВИТРО И В ВИВО МОДЕЛИ, представена от г-жа Laura Ana Corcuepira като г-жа Laura Ana Corcuepira като г-жа Laura Ana Corcuera Martine Университета в Навара, е осъществен в Департамента по хранителни науки, физиология и токсикология под ръководството на д-р Адела Лопес де Серен Салсаменди и съвместното ръководство на д-р Елена Гонсалес-Пеньяс Памплона, април 2012 г. Адела Лопес де Cerain Salsamendi Dra. Елена González-Peñas
Тази работа е финансирана от проектите: Микотоксини: токсичност на комбинираното лечение на охратоксин А и афлатоксин В1 в модели in vitro и in vivo Министерство на науката и иновациите на правителството на Испания Справка: AGL2008-01437/ALI Наличие на токсини в храната и нейното участие в човешкото здраве CAN Foundation Справка: 10829
На моето семейство от Памплона, Бегоня, Мигел, Ландър, Хавиер, Хосе, Асиер, Тхикитин, Мария, Маноло. че ме посрещна с толкова обич и ме накара да се почувствам като у дома си. На Ибан, за това, че предприема всяка стъпка с мен по този път, за ставането, когато падна и за вашето търпение. Благодаря ти, че ме обичаш толкова много и ме разбираш толкова добре. Тази теза също е ваша и бъдещето е наше. На семейството ми, че се грижи за мен. Ама, баба и дядо, които видяха началото и от небето виждат края. Ал Яйо, който може да се наслади на този триумф с мен. На чичо ми Игнасио и Бегоня, на Мария. На брат ми Луис, благодаря ви за насърчението, любопитството и възхищението ви, карате ме да искам да бъда по-добър всеки ден. Нищо не би било възможно без родителите ми, стълбовете на живота ми. Благодаря ви, че ме научихте, че добре свършената работа е самият успех. Благодаря ви за вашата любов, че вярвате в мен и ми дадохте да разбера, че мога. Това е и вашата награда. БЛАГОДАРЯ НА ВСИЧКИ! 9
Моите родители А Ибан Получиха го, защото не знаеха, че е невъзможно Жан Кокто
Съкращения/Съкращения Съкращенията/СЪКРАЩЕНИЯ 3-ADON: 3-ацетилдеоксиниваленол/3-ацетилдеоксиниваленол 8-оксо-ГД: 8-oxoguanine/8-oxoguanine 15 ADON: 15 ацетилдеоксиниваленол/15 ацетилдеоксиниваленол/Afto-B-ацетилдеоксиниваленол AF1Bto1xy1nivalenol AF1 FAPY: AFB1-формамидопиримидин/AFB1-формамидопиримидин AFB2: Афлатоксин B2/Афлатоксин B2 AFBO: AFB1-екзо-8,9-епоксид/AFB1-екзо-8,9-епоксид AFG1: Афлатоксин G1/Афлатоксин G1 AFG2: AftoG G1 AFG2 G2 AEFI: Испанска асоциация на фармацевтичните продукти в индустрията AOAC: Международна асоциация на химическите анализатори/Асоциация на официалните аналитични химици Сайт на AP: Apirimidinic или apurinic site AU: Произволни единици bw: Телесно тегло CIT: Citrinina/Citrinin CV: Коефициент на вариация DCFH- DA: Дихидрохлорфлуоресцеин диацетат/Дихидрохлорфлуоресцеин диацетат DL 50: Смъртоносна доза 50 DON: Дезоксиниваленол/Дезоксиниваленол DTI: Дневен приемлив прием ЕО: Европейска комисия/Европейска комисия EFSA: Европейски орган за безопасност Alimentaria/Европейски орган за безопасност на храните 13
Съкращения/Съкращения OECD: Организация за икономическо сътрудничество и развитие/Организация за икономическо сътрудничество и развитие OTA: Охратоксин A/Охратоксин A PBS: Фосфатен буфер/Буфериран с фосфат физиологичен разтвор бр: Телесно тегло PECE: Обогатен с полифенол какао екстракт/полифенол обогатен екстракт от какао pk a: Константа на дисоциация на киселината RE: Относителна грешка SCF: Научен комитет по храните към Европейската комисия/Научен комитет по храните SCOOP: Научно сътрудничество по хранителни въпроси/Научно сътрудничество по въпроси, свързани с храните) RF: Относителна флуоресценция ROS: Реактивни кислородни видове/Реактивни кислородни видове RSD: Стандартно отклонение/Относително стандартно отклонение SE: Стандартна грешка t 1/2: Елиминационен полуживот/Елиминационен полуживот T-2: Токсин T-2/T-2 токсин TWI: Поносим седмичен прием UA: Произволни единици UHPLC-LD: Течна хроматография с ултрависоко съотношение разтвор с ултравиолетов детектор/ултра високоефективна течна хроматография-флуоресцентен детектор UV: ултравиолетов детектор СЗО: Световна здравна организация/Световна здравна организация ZEA: Zearalenone/Zearalenone 15
СЪДЪРЖАНИЕ/СЪДЪРЖАНИЕ Глава 1/Глава 1 Общо/общо въведение Въведение 17 Глава 2 Цел, цели и очертания 55 Глава 3 Охратоксин А намалява индуцираното от афлатоксин В1 увреждане на ДНК, открито от анализа на кометата в Hep G2 клетки 61 Глава 4 Обогатен с полифенол какаов екстракт намалява свободните радикали, произведени от микотоксини 85 Глава 5 Валидиране на аналитичен метод на UHPLC-FLD за едновременно количествено определяне на афлатоксин В1 и охратоксин А в плазмата на плъхове, черния дроб и бъбреците 109 Глава 6 Подход към токсичността и токсикокинетиката на афлатоксин В1 и охратоксин А след едновременно перорално приложение на плъхове F344 135 Глава 7 Охратоксин А намалява генотоксичността на афлатоксин В1: Едновременно прилагане на in vivo микроядра и анализ на комети 159 Глава 8 Обща дискусия 187 Глава 9/Глава 9 Заключения/Заключения 207 17
Глава 1/Глава 1 Общо въведение/Общо въведение
Глава 1/Глава 1 AFLATOXIN B1 Химични свойства AFB1 принадлежи към семейството на дифуран кумарин. Систематичната му номенклатура е 2,3,6aα, 9aα-тетрахидро-4-метоксициклопента [c] -b-фуро [2 ', 3': 4,5] фуро [2,3-h] хромен-1,11-дион, C 17H 12O 6 е неговата молекулна формула е и теглото му е 312.27 g/mol. Незначителните вариации в неговата химическа структура пораждат набора от афлатоксини, които могат да бъдат намерени в природата (AFB1, AFB2, AFG1 и AFG2). AFB1 е този с най-висока концентрация, последван от AFG1, AFB2 и AFG2. Редът, който тези вещества следват по отношение на тяхната остра и хронична токсичност, е AFB1> AFG1> AFB2> AFG2 и е пряко свързан със способността да образуват епоксид при двойна връзка 8-9 (маркирана с червена стрелка на фигурата) и потентността, свързана с циклопентеноновите пръстени (синя стрелка) (McLean and Dutton, 1995). Афлатоксини М1 и М2 са продукти на хидроксилиране на окислителния метаболизъм на афлатоксини В1 и В2, съответно. Фигура 1: Афлатоксини, присъстващи в природата (EFSA, 2007) 24
Общо въведение/Общо въведение, предизвикващо образуването на 8-OHdG в черния дроб на плъх и патица. Това увреждане на ДНК може да предизвика G> T трансверсия, което би довело до принос за канцерогенността на AFB1 (Bedard and Massey, 2006). Фигура 4: Еволюция на адукта AFB1-DNA (Smela et al., 2002) 31
Глава 1/Глава 1, че OTA във фенолната си форма (OTA -) се превръща във феноксониев катион (фигура 8, J), който от своя страна се трансформира в OTAQ (фигура 8, K) (Ringot et al., 2006; Dai et ал., 2002). От друга страна, многократното приложение на OTA може значително да намали нивата на вътреклетъчните антиоксиданти като глутатион (GSH), супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT) или глутатион пероксидаза (GSPx) в черния дроб и бъбреците (Meki и Hussein, 2001) и увеличаване на липидната пероксидация (Khan et al., 1989). Изследванията на структурна активност предполагат, че хлорният атом е от съществено значение за генотоксичния ефект на OTA, тъй като хлорираните съединения, които предизвикват увреждане на ДНК, предварително преминават процес на биоактивиране на бензохинони (Ringot et al., 2006). Фигура 8: Образуване на ROS от OTA (Ringot et al., 2006) Проучванията на генната експресия показват, че OTA е способен да намали експресията на гени, участващи във вътреклетъчната окислителна защита, по-интензивно в черния дроб, отколкото в бъбреците (Cavin et al., 2007; Arbillaga et al., 2008); и това увеличава експресията на азотен оксид синтетаза 40