Характеризиране на протеиновия профил на щам

Университет в Гранада Институт по биотехнологии Ръководена изследователска работа за получаване на заглавие: магистър по биотехнологии Характеризиране на протеиновия профил на ентомопатогенен щам на Bacillus pumilus. Диана Каролина Гарсия Рамон, юли 2011 г. Учител: Съучител: Д-р Сузана Вилчес Торнеро Нает професор доктор Катедра по биохимия Институт по биотехнологии Университет в Гранада Д-р Антонио Осуна Карило де Алборноз Професор от Университета в Гранада Катедра по паразитология Университет в Гранада

Част от резултатите от тази изследователска работа са представени на 13-ата Европейска среща на конгреса на работните групи на IOBC/WPRS, чрез устно представяне, със заглавие: Разбиране на токсичността на Bacillus pumilus 15.1 спрямо средиземноморската плодова муха (Ceratitis capitata). Място: Инсбрук Австрия Дата: 19-23 юни 2011 г.

ИНДЕКСНИ ПРИЗНАВАНИЯ. ИНДЕКСИРАМ. V РЕЗЮМЕ. 1 СЪКРАЩЕНИЯ. 5 1. ВЪВЕДЕНИЕ. 9 1.1 Ентомопатогенни микроорганизми. 11 1.2 Ентомопатогенни бактерии. 13 1.2.1 Родът Bacillus. 14 1.2.2 Bacillus thuringiensis. 15 1.2.2.1 Фактори на вирулентност: Cry и Cyt токсини. 17 1.2.2.2 Други фактори на вирулентност. 19 1.2.2.3 Биотехнологични приложения. 21 1.3 Bacillus pumilus. 22 1.3.1 Биология. 22 1.3.2 Биотехнологични приложения. 24 1.3.2.1 Производство на ензими. 24 1.3.2.2 Производство на антибиотици. 26 1.3.2.3 Биологичен контрол. 27 1.3.2.3.1 Контрол на гъбичките и бактериите в растенията. 27 1.3.2.3.2 Контрол на насекомите. 30 1.3.2.4 Други приложения. 32 1.4 Bacillus pumilus 15.1. 32 2. ЦЕЛИ. 37 3. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ. 43 3.1 Условия за култивиране на бактериални щамове. 45 3.1.1 Бактериални щамове и тяхното опазване. 45 3.1.2 Културни среди. 46 3.1.2.1 Богата среда. 46 3.1.2.2 Спорулационна среда. 46 3.1.3 Условия за отглеждане. 47 3.2 Анализ на протеини. 47 3.2.1 Обработка на протеинови проби. 47 3.2.2 Протеинова електрофореза. SDS-PAGE. 3.2.3 Разделяне на протеините чрез захароза Градиент. 50 3.2.4 Микроскопия. 51 3.2.4.1 Оптична микроскопия. 51 3.2.4.2 Трансмисионна електронна микроскопия. 52 3.2.5 Имуноблоти. 52 3.2.6 Разтваряне на протеини. 54

3.2.7 Анализ и идентификация на протеини чрез MALDI-TOF. 56 3.2.8 Биопроби с C. capitata. 56 3.2.8.1 Поддържане на колонията от средиземноморски плодови мухи. 56 3.2.8.2 Биопроби с ларви. 58 4. РЕЗУЛТАТИ. 63 4.1 Протеинов профил на щама B. pumilus 15.1. 65 4.1.1 Протеинов профил на вегетативна култура. 66 4.1.2 Протеинов профил на спорообразна култура. 67 4.2 Разделяне на протеини чрез захарозни градиенти. 70 4.3 Наблюдение на B. pumilus 15.1 чрез микроскопия. 79 4.4 Анализ на фракциите от култура на B. pumilus 15.1 с използване на Имуноблот. 85 4.5 Разтваряне на протеини. 88 4.6 Идентифициране на протеини чрез пептиден анализ на пръстови отпечатъци или отпечатване на пръсти. 4.7 Активност на изолирани протеини в градиенти на захароза срещу ларви на C. capitata. 95 5. ДИСКУСИЯ. 99 6. ЗАКЛЮЧЕНИЯ. 109 7. БЪДЕЩА РАБОТА. 115 8. БИБЛИОГРАФИЯ. 121 ПРИЛОЖЕНИЯ. 141 Анализ и идентификация на протеини чрез MALDI-TOF. 143 37 kda протеин. 143 Протеин 17 kda. 144 Протеин 45 kda. 145 Протеин 60 kda. 146 Протеин 250 kda. 147

СЪКРАЩЕНИЯ (p/p) Съотношение тегло/тегло (p/v) Съотношение тегло/обем (v/v) Съотношение обем/обем

Приблизителни C градуса Целзий µg Микрограми µl Микро литри µm Микро метър 16S Прокариотна рибозома минорна субединица рРНК молекула ДНК Дезоксирибонуклеинова киселина APS Амониев персулфат РНК Рибонуклеинова киселина рРНК рибозомна РНК ATP Аденозин трифосфат Bturingin Bt. Цитолитен протеин Da Daltons DNAse Дезоксирибонуклеаза DTT Дитриотритол EDTA Етилендиаминтетраоцетна киселина g Грами H 2 O 2 Водороден пероксид HCl Солна киселина K 2 MnO 4 Калиев манганат kb Кило основи 5